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hPAK4基因重组质粒的构建及蛋白表达
目的 构建hPAK4真核表达载体,证实融合蛋白在细胞内表达,融合蛋白可以用于GST-pulldown实验.方法 提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA.PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有GST标签的真核表达载体中.将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测,同时进行GST-pulldown实验.结果 hPAK4全长基因序列克隆到真核表达载体pEBG中,酶切鉴定片段为1 800 bp.Western blot检测到融合蛋白GSThPAK4的表达,分子量约为94 kDa,融合蛋白能够被Ghtathione Sepharose 4B沉淀.结论 成功构建了hPAK4全长基因真核表达载体,同时鉴定了GST-hPAK4融合蛋白的表达,并且能够被Glutathione Sepharose 4B沉淀.
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PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
目的:构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定.方法:针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoRⅠ酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV.包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+9 TU·mL-1.将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70％以上.结论:成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导诵路中的研究提供工作基础.
