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改良TCA/丙酮沉淀法去除肥胖人群血浆中的高丰度蛋白质
目的 对传统的三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法进行改良,探索一种较好的高脂血浆的高丰度蛋白去除方法.方法 分别用不同体积(1、3、4、5、6、8、10和20倍样品体积)、不同TCA浓度(10％、30％、40％、50％、60％、70％)的TCA/丙酮溶液处理高脂血浆处理所得上清和沉淀蛋白样品分别进行一维十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证比较,确定去除效果佳的TCA/丙酮溶液,用该浓度TCA/丙酮溶液与含有10％三氯乙酸的TCA/丙酮溶液同时处理血浆,对所得沉淀蛋白进行二维SDS-PAGE验证,并对所得上清和沉淀蛋白质进行Nano HPLC-Chip-MS/MS鉴定比较.结果 4倍样品体积的TCA/丙酮溶液去除高丰度蛋白的效果较好,增加或减少TCA/丙酮溶液的体积都会影响去除效率；60％ TCA/丙酮溶液去除血浆中高丰度蛋白质的效率比10％、20％、30％、50％ TCA/丙酮好,而70％ TCA/丙酮溶液处理血浆的重复性较差.质谱鉴定结果显示,4倍样品体积的60％ TCA/丙酮溶液与10％ TCA/丙酮溶液处理后的血浆样品相比,可鉴定更多的低丰度蛋白质.结论 用4倍样品体积的60％ TCA/丙酮溶液去除血浆中高丰度蛋白质的效果为理想,尤其适用于较高脂含量的样品的处理.
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血浆蛋白质组学的研究进展
血浆蛋白质组学是研究血浆蛋白质的功能和变化的一门科学.血浆中蕴藏着生命机体的所有信息,因此只有彻底了解血浆中存在哪些蛋白质,才能知道如何利用血浆来预测人体对疾病的易感性并监控疾病的进程,以期达到对疾病进行早诊断早治疗.由于血浆蛋白质组动态范围大,给研究带来了很大的困难.尤其是高丰度蛋白质的存在影响了低丰度蛋白质的检测率.而低丰度蛋白质都是有意义的具有临床诊断价值的蛋白质.因此去除高丰度蛋白质的干扰成了血浆蛋白质组学研究的关键.近年来,血浆蛋白质组学相关研究技术也得到了长足进展,为深入研究血浆蛋白质做出了重要贡献.血浆蛋白质组学作为一种无创性的研究方法,值得我们去探讨.本文就血浆蛋白质组学研究进展情况做一简要综述.
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甲醇沉淀法去除人血清高丰度蛋白质的实验研究
目的 常用人血清高丰度蛋白质(high abundant proteins,HAP)去除方法操作较繁且成本高,文中探索建立简便有效的甲醇沉淀法去除人血清HAP.方法 用不同体积的甲醇处理血清样品,然后与原血清样品上样进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,并对去除HAP后的样品进行蛋白定量检测.结果 SDS-PAGE显示,经甲醇处理过的血清样品与原血清电泳结果 相比,相对分子质量在50000~80000 间的清蛋白等HAP被明显去除,血清清蛋白平均浓度显著降低,由(47.65±0.35)g /L下降至(1.16±0.08)g /L,去除率达97%以上,占血清总蛋白质比例由65.4%下降为49.3%,其差异具有统计学意义(P<0.01).同时一些被HAP掩盖的低丰度蛋白质(low abundant proteins,LAP)有所显现和保留.结论 甲醇沉淀法可简便有效地去除人血清中清蛋白等HAP,为进一步行血清蛋白质组学分析奠定基础.
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离心超滤法去除血清大相对分子质量高丰度蛋白质的实验研究
目的 建立离心超滤法去除血清中大相对分子质量高丰度蛋白质的实验方法,研究其去除效果及重复性.方法 取血清与20 %乙腈按1:4(V/V)混合,将混合后的血清分别加入相对分子质量分离点(MWCO)为100×103、50×103、30×103及10 ×103超滤膜离心管中,离心15 min(8000×g).滤液真空冷冻干燥后,以超纯水按浓缩10倍复溶.分别应用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳法和二元梯度高效液相色谱法(HPLC)分析比较血清中大相对分子质量高丰度蛋白质去除效果,考察经50×103 超滤膜离心去除血清中大相对分子质量高丰度蛋白质后保留低丰度蛋白质的重复性.结果 以选择MWCO 为50×103和30×103较为适宜.电泳分离结果显示,经离心超滤后滤过液中大相对分子质量高丰度蛋白质,特别是清蛋白得到有效去除.HPLC检测结果显示,选用MWCO为50×103超滤膜分离后,血清低丰度蛋白质数量保留适中.重复性统计结果显示,小相对分子质量低丰度蛋白质相对保留时间和相对峰面积RSD值分别小于0.46%和5.56%.结论 离心超滤法去除血清中大相对分子质量高丰度蛋白质步骤较为简便、重复性好,为进一步深入研究血清蛋白质组学奠定了基础.
