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Stargardt病相关致病基因的研究进展
Stargardt病(STGD)是一种黄斑营养不良性遗传性疾病,多见于青少年时期发病,尚无有效治疗法.近年来,对STGD致病基因的研究有了新的进展,现已发现4个染色体区段与本病相关,并将本病的致病基因已被克隆,通过体外表达研究相关蛋白突变体的性质.对于ABCR基因、Rim蛋白(RmP)、RDS基因、ELOVL4基因致病基因的结构、突变功能、蛋白突变体及其发病机制的研究目前已有了新的进展作一综述.
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Stargardt病Ⅲ型致病基因ELOVL4在脂肪酸代谢中的功能研究
背景 研究证实,超长链脂肪酸延伸酶4(ELOVL4)基因是Stargardt病的致病基因,且ELOVL4可能是C≥28的超长链脂肪酸的延伸酶,而常染色体显性遗传Stargardt病Ⅲ型(STGD3)的发病可能与视网膜中C≥28的超长链脂肪酸的代谢有关.探讨ELOVL4在STGD3发病中的作用及其与超长链脂肪酸代谢的关系有望对STGD3的治疗提供新的思路. 目的 探讨ELOVL4基因在STGD3发病和进展中的作用及机制.方法 将腺病毒(Ad)转染重组病毒质粒36 h的人胚肾293细胞(HEK293)以纯化病毒,构建携带ELOVL4基因和绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒载体并转入培养的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12),将培养的PC12细胞分成PC12组、PC12+ Ad5-GFP组和PC12+ Ad5-ELOVL4组,根据分组情况分别将Ad-GFP和Ad-ELOVL4病毒质粒按1×104～2×104噬斑形成单位(pfu/ml)的滴度加入含质量分数2％胎牛血清(FBS)的细胞培养液转导24 h,采用实时定量PCR法(qRT-PCR)定量分析各组细胞中ELOVL4 mRNA的相对表达量;采用Western blot法检测细胞中ELOVL4蛋白的表达.分别在各组培养基中加入花生四烯酸(AA或20:4n6)、二十碳五烯酸(EPA或20:5n3)和二十二碳六烯酸(DHA或22:6n3),孵育48 h后进行脂肪酸提取,通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析各组细胞中超长链脂肪酸产物. 结果 PC12+Ad-ELOVL4组、PC 12+ Ad-GFP组和PC12组间细胞中ELOVL4 mRNA表达水平(ELOVL4 mRNA/RPL19 mRNA)分别为0.833±0.138、0.027±0.002、0.024±0.002,3个组的总体差异有统计学意义(F=102.700,P=0.000),其中PC 12+ Ad5-ELOVL4组PC12细胞中ELOVL4 mRNA表达水平是PC12组和PC12+Ad5-GFP组的30 ～ 40倍;Western blot法检测结果证实,PC12+Ad5-ELOVL4组PC12细胞中ELOVL4蛋白呈阳性表达.GC-MS法检测发现PC 12+ Ad5-ELOVL4组PC12细胞中有C28-C38多不饱和脂肪酸的合成,其中均以C34和C36多不饱和脂肪酸合成量多.结论 ELOVL4蛋白酶可催化C28-C38多不饱和脂肪酸的合成,这个结论为STGD3患者的治疗提供了新的思路.
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Elovl4 mRNA在小鼠视网膜发育过程中的表达分布
目的 本研究旨在观察Elovl4基因mRNA在发育期小鼠眼中的分布.方法 在EST和HTGS信息库查寻Elovl4同源基因.用小鼠Elovl4探针在小鼠眼冰冻部位进行原位杂交.结果 小鼠视网膜Elovl4在胚胎发育的第15天(E15)开始表达并持续到出生后各阶段.在出生后1～3天(P1-P3),Elovl4主要在视网膜神经节细胞中表达,第七天(P7)主要在视网膜外核层表达,后的表达聚集在感光体内部节段上.结论 在视网膜发育期中Elovl4的表达呈动态图谱变化.胚胎期以及出生后早期主要在神经节细胞中表达,逐步转换至后期主要在感光体内部节段上表达.
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DHA 与 EPA 合成超长链多不饱和脂肪酸的效率比较
目的：比较在ELOVL4蛋白酶催化作用下，DHA和EPA合成超长链多不饱和脂肪酸VLC-PUFA的效率。方法构建携带ELOVL4基因和绿色荧光蛋白的重组腺病毒，转入培养的 PC12细胞，通过qRT-PCR定量分析ELOVL 4基因的表达量，WB检测ELOVL4蛋白的表达；1∶1加入DHA和EPA，孵育48 h之后进行脂肪酸提取，通过气相质谱 GC-MS分析超长链脂肪酸的成分。结果 GC-MS检测到分别用DHA及EPA处理后的PC12＋Ad-ELOVL4的细胞中有n3 VLC-PUFA的表达，34：5n3和36：5n3分别为0.85％和1.11％；34：6n3和36：63n分别为0.16％和0.29％；EPA所产生的五烯酸总和是DHA所产生的六烯酸总和的4倍。结论 EPA合成VLC-PUFA的效率远远高于DHA，为患者提供更高比例的 EPA，而非DHA，可能是治疗STGD3疾病的方式之一。
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ELOVL4基因过表达对 n3和 n6超长链多不饱和脂肪酸生物合成效率的影响
目的：ELOVL4是常染色体显性Stargardt氏黄斑变性的致病基因,ELOVL4蛋白酶参与n3和n6超长链多不饱和脂肪酸( very long chain polyunsaturated fatty acid,VLC-PUFA)的合成,比较两者的生物合成效率,对治疗Stargardt氏黄斑变性有指导意义。
方法：构建携带ELOVL4基因和绿色荧光蛋白的重组腺病毒,转入培养的PC12细胞,将细胞分成三组：PC12、PC12+Ad-GFP 和 PC12+Ad-ELOVL4,前两组为对照组,通过qRT-PCR定量分析 ELOVL4基因的表达量, Western Blot检测 ELOVL4蛋白的表达；等浓度(1：1)加入 EPA ( n3 PUFA)和AA(n6 PUFA),孵育48h之后进行脂肪酸提取,通过气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析超长链脂肪酸的成分。
结果：GC-MS检测到分别用EPA和AA处理后的PC12+Ad-ELOVL4的细胞中有n3 VLC-PUFA的表达,34：5 n3和36：5n3是20：5n3/EPA的主要产物,分别为0.71%和1.6%；34：4 n6和36：4 n6是20：4 n6/AA的主要产物,分别为0.46%和0.61%；EPA所产生的n3 VLC-PUFAs总和是AA所产生的n6 VLC-PUFAs总和的2倍。
结论：在ELOVL4蛋白作用下,EPA合成VLC-PUFAs的效率高于AA,饮食中给予适当比例的n3/n6 PUFAs,可能是治疗STGD3疾病的方式之一。
