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鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
目的 用RT-PCR技术扩增鸭坦布苏病毒(DTMUV) AH-F10株E基因,并克隆至pET32a(+)载体,构建重组表达质粒pET32a-E,表达E蛋白.方法 重组表达质粒转化感受态细胞BL21 (DE3),经IPTG诱导后,获得含6个His标签的融合蛋白,大小约54 kDa.表达的蛋白以包涵体形式存在.对目的蛋白进行纯化,用纯化的E蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体血清.结果 SDS-PAGE和Western blot试验结果表明E基因在大肠埃希菌中成功表达,并能与抗DTMUV多克隆抗体产生特异性反应,具有良好的反应原性.间接免疫荧光试验表明免疫小鼠后获得的多克隆抗体能与DTMUV反应.结论 本研究为DTMUV新型疫苗和诊断试剂盒的进一步研究奠定了基础.
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鸭坦布苏病毒感染对BHK-21细胞分泌胞外体的影响
目的:探讨鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞对胞外体的影响,进一步研究鸭坦布苏病毒的致病机制.方法:利用鸭坦布苏病毒AH-F10株感染BHK-21细胞,并设置未感染病毒的对照组.用PEG法提取感染病毒的BHK-21细胞和对照组细胞上清中的胞外体,通过电镜观察、Western blot检测对胞外体进行鉴定,并对提取的两组胞外体进行质谱鉴定分析.结果:电镜观察到纯度高的内部色浅、边缘浓染的杯状囊泡,直径30~160 nm.感染组胞外体的平均粒径大小大于对照组胞外体的平均粒径大小.Western blot试验中,均检测出CD9、CD63分子.应用液相质谱法从胞外体中鉴定出106种蛋白,其中感染坦布苏病毒组共检测出84种蛋白,对照组49种蛋白,有27种共同蛋白分子.结论:鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞会影响细胞胞外体的分泌,影响胞外体粒径大小及其蛋白组成成分.本试验为进一步研究坦布苏病毒的感染和致病机制奠定了基础.
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鸭坦布苏病毒甲基转移酶的序列分析和结构预测
为了确定鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)发挥甲基转移酶(methyltransferase,MTase)功能的氨基酸序列.本研究运用生物信息学方法,以已知的黄病毒MTase的序列和结构为模板,对GenBank上注入的DTMUVMTase序列进行同源比对分析和结构预测.分析结果表明,DTMUV MTase与WNV,DENV-2,JEV三种病毒MTase的核酸序列同源性分别为64.76％,64.55％,67.33％,氨基酸序列同源性分别为74.71％,68.45％,75.15％;其可能结构含有SAM结合位点且具有典型的4个α螺旋和7个β折叠的黄病毒MTase的结构特点;同时,DTMUV MTase序列上存在黄病毒MTase经典保守位点K-D-K-E;从而为确定DTMUV MTase属于黄病毒MTase家族成员提供一些理论依据.
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抗鸭坦布苏病毒非结构蛋白1(NS1)多克隆抗体的制备和应用
目的 原核表达鸭坦布苏病毒(DTMUV)非结构蛋白1(NS1)蛋白,并制备小鼠抗NS1多克隆抗体.方法 利用PCR从DTMUV AH-F10株cDNA中获得NS1基因,亚克隆至pET-32a中进行原核表达,对表达产物进行鉴定.使用含尿素的Tris缓冲液洗去杂蛋白再梯度复性,纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备小鼠抗NS1多克隆抗体,琼脂扩散试验测定抗体效价,Western blot法鉴定该抗体的特异性与反应原性,将抗体应用于病毒的间接免疫荧光法(IFA)检测.结果 获得鼠抗NS1蛋白多克隆抗体,效价达到1∶8;Western blot结果表明该多抗血清具有良好的特异性和反应性,且可以应用于病毒的IFA检测.结论 成功制备了鼠抗NS1多克隆抗体.
关键词： 鸭坦布苏病毒 非结构蛋白1(NS1) 多克隆抗体 原核表达
