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流感病毒非结构蛋白对TBK-1的抑制作用
目的流感病毒非结构蛋白1(nonstructural protein 1, NS1)抑制干扰素调节因子(interferon regulatory factors, IRF) 3的机制未明,TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1, TBK-1)能使IRF-3活化,研究NS1是否对TBK-1有抑制作用. 方法亚克隆IRF-3、NS1和TBK-1至pcDNA3.1-flag构建flag-IRF-3、flag-NS1和flag-TBK-1质粒;用TBK-1对TBK-1+NS1以及IRF-3+TBK-1对IRF-3+TBK-1+NS1两组实验,分别共转染人胚胎肾上皮293细胞,用抗flag抗体作Western blot分析,鉴定IRF-3、NS1和TBK-1的表达,观测NS1对TBK-1活化IRF-3的抑制作用;荧光素酶功能分析方法观测NS1对TBK-1诱导的干扰素β(IFN-β)启动子-pGL-2B荧光素酶活性的影响. 结果 IRF-3、NS1和TBK-1均有高表达.TBK-1能使IRF-3活化,Western blot分析显示:TBK-1转染的细胞出现迁移较慢的IRF-3Ⅲ和Ⅳ型,NS1共转染可使IRF-3 Ⅲ和Ⅳ型几乎消失;荧光素酶功能分析显示,NS1能抑制TBK-1活化内源性IRF-3所诱导的IFN-β启动子活性,约为对照组的1/4,TBK-1+IRF-3共转染可使IFN-β启动子活性增高近1000倍,NS1可使TBK-1活化外源性IRF-3所诱导的IFN-β启动子的活性降至对照组的约1/2至1/3. 结论流感病毒NS1可抑制TBK-1所致的IRF-3活化,功能分析提供了NS1显著抑制TBK-1诱导的IFN-β启动子活性的证据,首次阐明了流感病毒NS1抑制IRF-3因而抑制干扰素β产生的机制之一是通过TBK-1信号通路所取得,为新的抗病毒治疗及新药开发战略提供了基础.
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抗鸭坦布苏病毒非结构蛋白1(NS1)多克隆抗体的制备和应用
目的 原核表达鸭坦布苏病毒(DTMUV)非结构蛋白1(NS1)蛋白,并制备小鼠抗NS1多克隆抗体.方法 利用PCR从DTMUV AH-F10株cDNA中获得NS1基因,亚克隆至pET-32a中进行原核表达,对表达产物进行鉴定.使用含尿素的Tris缓冲液洗去杂蛋白再梯度复性,纯化重组蛋白,并免疫小鼠制备小鼠抗NS1多克隆抗体,琼脂扩散试验测定抗体效价,Western blot法鉴定该抗体的特异性与反应原性,将抗体应用于病毒的间接免疫荧光法(IFA)检测.结果 获得鼠抗NS1蛋白多克隆抗体,效价达到1∶8;Western blot结果表明该多抗血清具有良好的特异性和反应性,且可以应用于病毒的IFA检测.结论 成功制备了鼠抗NS1多克隆抗体.
关键词： 鸭坦布苏病毒 非结构蛋白1(NS1) 多克隆抗体 原核表达
