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大鼠骨髓间质干细胞可以成为PEX基因稳定转染的载体细胞吗?
背景:PEX基因能够干预恶性胶质瘤的侵袭行为,而骨髓间质干细胞是一种靶向肿瘤治疗的新型细胞载体.目的:建立稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞.方法:采用分子克隆技术构建PEX基因真核表达载体,酶切测序鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-PEX,并转染大鼠骨髓间质干细胞,免疫细胞化学法验证真核表达载体在骨髓间质干细胞中的表达.通过G418筛选建立稳定表达PEX基因的骨髓间质干细胞,并用RT-PCR法检测PEX基因的表达.结果与结论:实验成功构建稳定表达PEX基因的大鼠骨髓间质干细胞,基因水平和蛋白水平检测结果表明,PEX在转染的骨髓间质干细胞中呈高表达.
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基质金属蛋白酶-2 C端片段pex的克隆、测序及真核表达载体的构建
目的:克隆小鼠基质金属蛋白酶-2(MMP-2)C端片断pex编码区的cDNA序列,并构建其真核表达载体,为进一步研究其抑制肿瘤作用奠定基础.方法:根据基因GenBank中MMP-2基因的碱基序列,利用RT-PCR的方法从NIH3T3细胞中分别扩增信号肽及目的基因pex,然后用多重PCR的方法将两个片段拼接起来,再将拼接起来的目的片段sig-pex与pMD18T载体连接作全自动测序,利用亚克隆的方法将sig-pex cDNA片段克隆到pcDNA3.1载体中.结果:DNA测序证实该片断序列与文献报道完全一致.结论:成功构建出pcDNA3.1-sig-pex真核表达载体.
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含MMP-9信号肽、人MMP-2 PEX片段腺病毒载体的构建及其生物学活性
目的:构建含MMP-9信号肽、人MMP-2 PEX片段融合蛋白的重组腺病毒(ET-M9-PEX),通过基因治疗策略建立患者体内药物生物反应器,以期利用抗血管因子的体内表达实现肿瘤的有效治疗.方法:利用PCR、基因重组等技术,构建含M9-PEX融合蛋白的腺病毒载体,经L293细胞包装、扩增后得到有感染力的ET-M9-PEX重组腺病毒.用Western blotting和免疫荧光检测其感染细胞后PEX的表达和分泌,通过生长曲线观察其感染内皮细胞(endothelial cell,EC)的培养上清对EC增殖的影响,利用鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)实验检测其对血管发生和种植瘤生长的影响.结果:ET-M9-PEX构建成功,感染细胞后有PEX的表达和分泌.体外实验表明,ET-M9-PEX感染细胞的培养上清能抑制EC增殖.体内实验证实,ET-M9-PEX感染后的PG细胞接种于CAM,与E-T相比,对瘤重的抑制率为57.57%(P＜0.01),对一级血管的抑制率为33.52%(P＜0.01);而E-T和PBS组之间瘤重和一级血管数均无显著性差异.结论:构建的ET-M9-PEX重组腺病毒能显著抑制EC细胞增殖,抑制CAM种植瘤生长和血管发生,ET-M9-PEX有望成为肿瘤基因治疗的有效药物.
