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卡介苗D2株分泌蛋白基因植物表达载体的构建
目的克隆卡介苗(BCG)D2株32-kDa分泌蛋白基因(fbpA基因),构建重组植物表达载体pBI121-fbpA,为研制转基因植物口服疫苗奠定基础.方法采用PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离fbpA基因,构建重组克隆载体pUCm-T-fbpA,经过单菌落PCR法、BamHⅠ、SacⅠ和HindⅢ单双酶切、DNA序列分析鉴定后,将fbpA基因亚克隆入植物表达载体pBI 121,得到重组载体pBI 121-fbpA,并转化根癌农杆菌株EHA105,用PCR法对其进行鉴定.结果重组载体pUCm-T-fbpA测序后证实fbpA基因由1 041 bp组成,包括1个1 014 bp的开放阅读框.DNA序列上游由编码一段信号肽的129 bp组成,并对32-kDa蛋白的分泌起决定作用.相应的编码成熟蛋白的序列由885个碱基组成.fbpA基因与来源于BCG1173P2株的同一基因序列完全一致.此外,构建的重组植物表达载体pBI121-fbpA成功转入根癌农杆菌株EHA105.结论编码BCGD2株32-kDa分泌蛋白的fbpA基因分离成功,DNA序列分析证实fbpA基因在分枝杆菌中高度保守,为进一步深入分析fbpA基因以及研制抗结核病转基因植物疫苗奠定了基础.
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单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株的构建
目的 构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株.方法 克隆fbpa及其上、下游基因,构建其载体质粒；通过酶切反应将上、下游基因分别重组到载体质粒中,形成同源重组质粒；同源重组质粒电转入细菌内,进行同源重组；采用PCR、Western blot鉴定敲除菌株.结果 单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株基因组DNA无fbpa基因片段,且无FbpA蛋白表达.结论 成功构建单核细胞增生性李斯特菌fbpa基因敲除菌株.
关键词： 单核细胞增生性李斯特菌 fbpA 基因敲除
