浓度咪唑安定(Midazolam)名咪达唑仑或咪唑二氮卓，合成于1979年，由于具有成盐水溶性和消除半衰期短的特点，是目前临床麻醉中应用广的苯二氮卓类药物。为研究咪唑安定血药质量浓度与其药效学之间的关系，我们用高效液相色谱法(HPLC)测定人血浆中咪唑安定的质量浓度，为临床合理用药提供依据，现将结果报道如下。

　　1资料和方法

　　1．1一般资料

　　1．1．1仪器美国安捷伦液相色谱仪，G1311A四元梯度泵及G1322AA真空泵，DAD1515B-"极管阵列检测器，HP1200色谱工作站。

　　1．1．2药品和试剂咪唑安定对照品、安定对照品由上海安普科学仪器有限公司提供；乙腈、甲醇为色谱纯，由天津四友公司提供；其他试剂均为分析纯。

　　1．2方法

　　1．2．1标准溶液的制备称取咪唑安定、安定对照品各lmg，分别置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配置成10mg·的母液，保存于4~C冰箱。

　　1．2．2磷酸盐缓冲液的配制称取磷酸二氢钾2．7218g、磷酸氢二钾4．5644g，分别置于1000mL容量瓶中，加水溶解，定容。取100mL磷酸二氢钾溶液和250mL磷酸氢二钾溶液混合，即得磷酸盐缓冲液。

　　1．2.3标本的制作、保存、处理和血药质量浓度测定取健康成人新鲜全血，迅速加入含肝素的试管中，4000r／min离心10min，吸取上层血浆至戴塞玻璃试管中，置冰箱4C保存备用。取1．0mL含药血浆至10mL玻璃试管中，加入l0L内标液(10mg·L安定)和0．5mLNaOH(2mol·L)，涡旋10S，再加入萃取液(正己烷：二氯甲烷：异丙醇=64：33：3)3．5mL，涡旋20s，300r／min，离心10min，取有机相(上层)2．5mL移人至另一干燥的5l玻璃管内，氮气吹干，加人流动相100IXL，涡旋3min，进样20L，经HPLC分析测定。

　　1．2．4色谱条件流动相：甲醇．乙腈．磷酸盐缓冲液72：3：25(V：v=v)；色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂HypersilODSC18，250toni×4．6mm，5m；柱温：35℃；流速：1．0mL·min～；检测波长：220rim；进样量：2OL。

　　1．2．5标准曲线的制作于空白血浆中加入不同质量浓度的咪唑安定标准溶液，使其血浆质量浓度分别为1、5、10、50、100、500、1000、5000g·L～，按照1．2．3的方法进行测定。由色谱图计算样品峰面积A样和内标峰面积A标的比值A样／A标)，以血药质量浓度(g·L)，用加权小二乘法作回归计算，得标准曲线方程。

　　1．2．6精密度于空白血浆中加入不同质量浓度的咪唑安定标准溶液，使其血浆质量质量浓度分别为10、100、1000g·L(分别为低、中、高质量浓度)，按照1．2．3的方法进行测定。3种质量浓度的供试液分别在第l天和第3天内，每隔4h测定其质量浓度，计算日内、日间精密度。

　　1．2．7回收率实验取咪唑安定标准溶液，用甲醇配制成质量浓度分别为10、100、1000g·L的溶液(分别为低、中、高质量浓度)，每种各11nL，加入内标液10L，混匀，氮气吹干，加入流动相100L涡旋3min，吸取2OL经HPLC分析测定，得咪唑安定峰面积A1。于空白血浆中加入不同质量浓度的咪唑安定标准溶液，使其血浆质量浓度分别为lO、100、1000IXg·L～，按照1．2-3的方法经HPLC分析测定，得咪唑安定峰面积A：，根据方程计算咪唑安定的测定质量浓度C涮。提取回收率=(7XA2)／(5×A1)×100％，方法回收率=CC标准×100％。

　　1．2．8稳定性实验于空白血浆中加入咪唑安定标准溶液，配置成质量浓度为100IXg·L的溶液，按照1．2．3的方法，取0、3、6、12、24、36、48h不同时间点进行测定，记录每次测得的质量浓度。

　　1．3统计学处理用SAS8．0统计学软件进行分析。

　　2结果

　　2．1专属性咪唑安定和安定的保留时间分别为5．018min和8．161min，血浆内源性物质不影响咪唑安定的测定。

　　2．2标准曲线标准曲线方程为：y=O．012x+0．434(产0．9964，P<0．001)，表明咪唑安定质量浓度在10-1000g·L范围内与峰面积比呈良好的线性关系，以信噪比值(S／N)I>3确定的低检测质量浓度为1g·L。

　　2-3精密度日内精密度：10、100、1000g·L人血浆中咪唑安定质量浓度的测定值分别为(10．14±0．49)、(104．49±4．92)和(1047．43~48．79)g·L，RSD值分另Ⅱ为4．83％、4．71％和4．66％。

　　日间精密度：10、100、1000g·L人血浆中咪唑安定质量浓度的测定值分别为(9．85+0．57)、(102-35±5．87)~(1065．15__44．92)ixg·L，别为5．79％、5．74％和4．22％。

　　2．4回收率实验10、100、1000g·L人血浆提取回收率各为(79．43±3．05)％、(83．98±3．30)％和(85．75±3_35)％，RSD值分别为3．84％、3．93％和3．91％；方法回收率分别为(96．56+-5．12)％、(104．87~6．38)％和(102．98±6．65)％，RSD值分别为5．30％、6．08％和6．46％．2．5稳定性实验100g·L的咪唑安定血浆在0、3、6、12、24、36、48h测得的质量浓度分别为98．83、104．92、102．66、106．36、95．91、96．71和94．35g·L，RSD值为4．70％。咪唑安定的化学名称为1一甲基一8．氯一6．(2一氟苯)．4H．咪唑并[1，5-a苯并二氮杂卓，常温下为白色至微黄色的结晶或结晶性粉末，无臭，遇光渐变黄，熔点为160164~C，为亲脂性物质，在冰醋酸或乙醇中易溶，在甲醇中溶解，在水中几乎不溶。临床所用的制剂为其盐酸盐或马来酸盐，pH3．3，可与盐酸吗啡等酸性药物相混。

　　咪唑安定的化学结构上具有融合的咪唑环，在2位上有碱性氮。根据其结构特点，在实验过程中，先碱化血浆使其以分子形式存在，再用有机溶剂提取，挥干后以醇回提。在萃取实验中，比较了碱化血浆溶液与不碱化血浆溶液的萃取率，并对碱化溶液的用量进行了实验考察，结果使用2mol·LNaOH可使萃取率得到较大的提高，这与文献报道一致。在萃取溶剂的选择上，根据文献报道对乙醚、氯仿、二氯甲烷．乙酸乙酯(80：20)、二氯甲烷．乙醚(2：3)、正己烷．异丙醇一二氯甲烷(64：3：33)5种提取液进行考察，发现用氯仿进行提取时，由于提取溶剂较血浆重，有机溶剂在血浆层下，实验操作时有机层不易被吸取出，且容易发生乳化现象，影响咪唑安定的提取率；用乙醚、二氯甲烷．乙醚(2：3)提取时杂质较多，干扰样品的测定；用二氯甲烷．乙酸乙酯(80：20)和正己烷．异丙醇．二氯甲烷(64：3：33)提取时其回收率高、杂质少，但是二氯甲烷．乙酸乙酯(80：20)比正己烷．异丙醇．二氯甲烷(64：3：33)难挥发，因此终确定正己烷一异丙醇一二氯甲烷(64：3：33)为萃取液。

　　关于流动相，各种文献报道不尽相。本实验采用甲醇一乙腈一磷酸盐缓冲液72：3：25(体积比)作为流动相，咪唑安定和内标的保留时间分别为5．018和8．161min，且血浆内源性物质不影响咪唑安定的测定，说明该方法有很好的专属性。

　　实验结果中，日内精密度RSD≤4．83％，日间精密度RSD≤5．79％，稳定性RSD≤4．70％，提取回收率RSD≤3．93％，方法回收率RSD<6．46％，RSD均在10％以内，表明该方法精确、稳定、可靠，符合实验要求。

　　本实验所建立的高效液相色谱法测定咪唑安定在人血浆中的质量浓度，提取方法可靠、专属性理想、稳定性好，适合临床进行咪唑安定的药学研究。