众所周知，性染色体XX和XY的胚胎会分别发育成女性和男性，拥有各自特有的性腺。但颠覆认知的是，拥有XX染色体，却发育出男性睾丸???

　　近，Caroline Eozenou等人在PNAS发表了一篇研究论文Testis formation in XX individuals resulting from novel pathogenic variants in Wilms’ tumor 1 (WT1) gene，发现WT1基因的ZF4的变异导致拥有46，XX个体的睾丸发育。

PNAS：Testis formation in XX individuals resulting from novel pathogenic variants in Wilms’ tumor 1 (WT1) geneWT1基因的ZF4的变异导致拥有46，XX个体的睾丸发育

　　01研究思路

　　假设与 WT1p.Arg495Gly 变体相关的睾丸发育可能是由于卵巢中睾丸特异性途径的不适当激活所致，或者是通过直接激活抗议基因或通过破坏通常与睾丸形成相反的途径而间接引起的。

　　研究了78名病因不明的46，XX TDSD/OTDSD儿童患者，通过外显子组数据集分析或候选基因的直接Sanger测序，对所有患者进行已知引起DSD的基因变异筛选，后建立小鼠WT1p.Arg495Gly模型证明假设。其中，46，XX TDSD是睾丸小且无精子症以及有正常男性习性的男性个体;46，XX OTDSD是指在性腺中同时有卵巢和睾丸组织的个体。

　　02研究结果

　　1、所有46，XX TDSD/OTDSD患者均出现有不同程度的性腺男性化。

　　研究发现，患者1，2，3表现为46，XX TDSD，其外生殖器不典型，睾丸小而畸形，睾丸组织有纤维化和透明的小管，间质细胞增生，但没有精子，却有男性正常习性。

　　患者4表现为46，XX OTDSD，其性腺显示细胞卵巢样基质中的发育不良的生精小管。患者5a和5b是一对兄弟姐妹，分别患有46，XX OTDSD和46，XY性腺发育不全的Meacham综合征。

　　患者5a的睾丸小而畸形，有生精小管，但没有精子。患者5b双侧睾丸未发育，但左侧有精索和附睾组织。

　　患者6号表现为46，XX TDSD，有睾丸组织，但是不能产生精子。患者7表现为先天性膈疝，单孔会阴开口，阴蒂肥大，盆腔超声显示双角子宫，卵巢明显正常，疑似46，XX OTDSD，但没有进行性腺活检。

　　从78个不相关的46，XX TDSD/OTD发现在WT1中携带5种不同的新变体(p.Arg495Gly;p.Pro481Leufs*15;p.Arg495Gln;Lys491Glu;p.Ser478Thrfs*17)。

　　所有46，XX TDSD/OTDSD确诊患者均出现有不同程度的性腺男性化，而且在46，XX-TDSD/OTDSD和46，XY-Meacham综合征患者群体均发现WT1基因的ZF4致病性变异。

PNAS：Testis formation in XX individuals resulting from novel pathogenic variants in Wilms’ tumor 1 (WT1) geneWT1基因的ZF4的变异导致拥有46，XX个体的睾丸发育

　　2、WT1 p.Arg495Gly改变蛋白质的生物活性

　　研究人员发现WT1在基质细胞和FOXL2阳性颗粒细胞亚群中均有表达。采用瞬时转染法测定WT蛋白和突变WT1蛋白在人胚肾HEK293-T细胞中的亚细胞定位，观察到突变蛋白和WT蛋白的强核定位。通过电泳迁移率转移分析，发现突变蛋白维持DNA结合活性。

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　　3、睾丸特异性增强因子SOX9和卵巢特异性FOXL2启动子激活的激活异常可影响WT1基因的ZF4。

　　通过对瞬时转染的HEK293-T细胞进行报分析，结果显示WT1p.Arg495Gly与辅助因子GATA4/FOG2和NR5A1一起，睾丸特异性增强因子SOX9的激活显著增加，还显示卵巢特异性FOXL2启动子激活的剂量依赖性降低。

　　研究人员发现突变的WT1蛋白与野生型的FOXL2蛋白有相似的结合，将WT1 p.Arg495Gly瞬时转染人颗粒KGN-1细胞系可导致与支持细胞形成相关的SOX9，NR5A1，DMRT1表达水平上升，而内源性颗粒转录物FOXL2，βCATENIN，FST的表达水平保持不变;同时，观察到转染KGN-1细胞后内源性SOX9表达增加，这影响了ZF4(WT1 p.Arg495*和WT1 p.Lys491Glu)，而内源性FOXL2水平保持不变。

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　　4、WT1Arg495Gly小鼠模型显示XX胚胎性腺的雄性化。

　　通过构建WT1p.Arg495Gly小鼠模型，发现与没有突变的WT1一样，XY纯合子Wt1Arg495Gly/arg495gly是细长的，不形成睾丸索。XX纯合子Wt1Arg495Gly/Arg495Glygonads也很薄，细长，部分阳性，体腔血管清晰，它通常只在睾丸或关键卵巢基因缺失的XX小鼠的雄性腺中发现，特别是Wnt4或Rspo1。

　　纯合子Wt1Arg495Gly/Arg495Gly XX性腺与WT和杂合子性腺相比，性腺较薄，FOXL2表达细胞较少，并且出现SOX9阳性细胞。

PNAS：Testis formation in XX individuals resulting from novel pathogenic variants in Wilms’ tumor 1 (WT1) geneWT1基因的ZF4的变异导致拥有46，XX个体的睾丸发育

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　　qRT-PCR发现纯合子Wt1Arg495Gly/Arg495Gly性腺显示FOXL2的表达水平下降了80%以上，FOXL2是维持卵巢同一性所必需的基因，其他卵巢标记物如Wnt4或Bmp2的表达没有变化。一些睾丸标志物(Wt1, Sf1, Sox9,Dmrt1,Fgf9)的表达水平显示出边缘性的增加。检测XY纯合子Wt1Arg495Gly/arg495gly证实睾丸索缺失，少量散在表达SOX9的细胞和大量FOXL2阳性细胞。

　　与XX性腺一样，WT1蛋白在细胞核内强烈表达。大多数杂合子XX Wt1Arg495Gly/+雌性小鼠外观正常并且完全可以生育，但是研究观察到3个具有明显雄性特征的雌性小鼠。在6周左右，即达到性成熟时检查小鼠，发现其阴道闭锁，肛门和生殖器之间有一个类似于雄性外生殖器的增大和凸起。然而，对这些XX小鼠的性腺解剖，发现存在相对正常的卵巢，而且子宫非常大。巨大的子宫的出现可能是由于阴道闭锁和阴道分泌物的积聚，而不一定是外生殖器的雄性化。

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　　03结论

　　综上所述，在携带纯合子 WT1 Arg495-Gly / Arg495Gly等位基因的46，XX小鼠的胚胎性腺中观察到部分性逆转强烈，即破坏WT1的ZF4可在人类和小鼠的XX 染色体环境中导致性腺雄性化。

　　在特异性影响WT1的ZF4变异可导致XX胚胎发育过程中雌性性腺途径的直接或间接抑制和雄性性腺途径的激活，从而促进睾丸形成，这也是46，XX TDSD/OTDSD出现的原因。