(温州医学院附属第一医院心内科)

[摘要]目的构建携带SLC7A8基因的重组腺病毒载体,为进一步研究SLC7A8基因的功能作准备。方法含SLC7A8目的基因编码序列( coding domain sequence, CDS)的互补DNA( complementary DNA,cDNA)的pGEM -TEasy载体测序分析正确后,再将其连接入重组腺病毒载体。以双酶切和测序鉴定正确后,将pAdxsi - GFP - SLC7A8重组腺病毒载体转染大鼠肾小管上皮细胞(rat renal tubular epithelial cells - 52e, NRK - 52日,流式细胞仪 测定转染效率,反转录聚合酶链反应法检测转染后SLC7A8 mRNA的表达。结果pAdxsi - GFP - SLC7 A8重组腺病毒载体构建成功,流式细胞仪测定重组腺病毒载体转染NRK -52E效率为94.1%,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7A8 mRNA表达。结论本研究成功构建pAdxsi - GFP - SLC7 A8重组腺病毒载体,并成功转染NRK -52E细胞,这为我们进一步探索SLC7A8基因的生物学功能奠定了基础。

[关键词]高血压;腺病毒科;基因;大鼠 doi: 10. 3969/j. issn.

[中图分类号}盯44.1(文献标志码] A(文章编号] 1∞7-3205(2012)01拍08-04

CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF THE RECOMBINANT ADENOVIRAL VECTOR WITH RAT SLC7A8 GENE

HONG Chenglv, WANG Benji, YANG Deye, ZHANG Huaiqin

(1. Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,ZhejiangProvince, Wenzhou 325000, China)

ABSTRACT: Objective To construct the recombinant adenoviral vector with rat SLC7 A8 gene for its function study in spontaneously hypertensive rat. Methods The pGEM - T Easy vector which contained SLC7 A8 complementary DNA( cDNA) was confilmed by sequence analysis. Then the pGEM - T Easy vector which contained SLC7 A8 cDNA was cloned into the recombinant adenoviral vector and the recombinant adenoviral vector was confirmed by double enzyme digestion analysis and DNA sequencing. The recombinant adenoviral vector pAdxsi - GFP - SLC7 A8 was transiently transfected into NRK - 52E cells and the transfection efficiency was detected by flow cytometry. The level of expression of SLC7 A8 mRNA was identified by reverse transcription - polymerase chain reaction ( RT - PCR). Results The recombinant adenoviral vector was constructed successfully. The transfection efficiency was 94. 1 % detected by flow cytometry. Over - expression of SLC7 A8 mRNA was observed in NRK - 52E cells transfected with SLC7 A8 gene. Conclusion The recombinant adenoviral vector pAdxsi - GFP - SLC7 A8 was successfully constructed and over - expression of SLC7 A8 gene in NRK - 52E cells was obtained. The recombinant adenoviral vector will be used to investigate the biologic role of SLC7 A8 in hypertension.

KEY WORDS: hypertension; adenoviridae ; genes; rats

高血压是我国人群脑卒中及冠状动脉粥样硬化性心脏病发病及死亡的主要危险因素,患病率仍呈增长态势。其发病机制认为原发性高血压是一种整合基因因素和环境因素(纳盐、酒精过量和肥胖)的疾病。研究发现多巴胶及其受体和影响其信号转导均与高血压密切相关[1-飞在国外也已完成了一些已知基因(如血管紧张素E、血管紧张素受体、肾素、激肤及心饷素等)在动物体内进行转基因过度表达或基因敲除研究LIO我们采用白发性高血压大鼠(spontaneously hype由nsive rat, SHR)和Wi star - kyoto大鼠( Wistar - kyoto rat, WKY)为动物 模型,用基因芯片技术初步筛选出新的高血压相关基因,芯片发现SLC7A8基因的表达水平在SHR组中比WKY组上调9.3倍[ 4]。本研究构建了携带该基因的腺病毒载体,为探讨SLC7A8在高血压形成发展中的生物学功能作准备。

1材料与方法

1. 1材料:DH5α菌种,超级感受态细胞制备试剂 盒购自碧云天生物技术研究所;含SLC7A8目的基因编码序列(coding domain sequence, CDS)的pGEM -T Easy载体原始质粒(由本试验室提供); 质粒抽提试剂盒均购自Omega公司; pShuttle -CMV -GFP重组穿梭载体和pAdxsi重组腺病毒骨 架载体由诺赛基因组研究中心有限公司提供;大鼠肾小管上皮细胞(rat renal tubular epithelial cells -52e,NRK -52日,购自中国科学院上海生命科学研 究院细胞资源中心。

1.2含SLC7A8目的基因CDS的eDNA的pGEM -T Easy载体原始质粒的准备:从WKY大鼠 肾脏组织提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM - T Easy载体测序分析正确,以上原始质粒的完成由本实验室提供。

1.3重组穿梭载体构建:将pShuttle - CMV - GFP 重组穿梭载体用Not!酶切,切胶回收约5.2kb目的基因片段,酶切、电泳及用DNA凝胶回收与纯化试剂盒回收.将处理好的载体片段和插入片段用T4DNA连接酶进行连接,取3?L连接产物转化化学感 受态细胞DH5a菌株,挑取若干单克隆菌落,接种到卡那抗性液体培养基中,培养过夜,小提质粒。

1.4重组腺病毒载体质粒构建:将验证正确的 pShuttle - GFP - SLC7 A8转移到pAdxsi载体上,得 到pAdxsi - GFP - SLC7 A8病毒质粒。I - CeuI +1- SceI双酶切处理pAdxsi载体,并做牛小肠碱'性磷 酸酶(alkaline phosphatase of calf intestine, CαIP川)去磷酸化处理,上述酶切反应体系中加入lω0%毛十二烧基硫酸$铀内(sodium do叫de倪cyρI sulfate, SDS ) 7巧5't:灭活lOmin,用乙醇沉淀法回收载体, I卜- Ceul+叶I-S阮C臼el双酶切处理插人片段p岗Shut

目的基因的片段,酶切完成后加样至1号%毛琼脂糖凝胶,电泳,在紫外灯下切下目的片段,用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)回收,将处理好的载体片段和插入片段用T4 DNA连接酶进行连接,取3?L连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株,涂 布到氨韦抗性固体培养基平皿,挑取若干单克隆菌落,接种到氨韦抗性液体培养基中培养过夜,小提质粒。

1.5重组腺病毒载体的包装,收毒及扩增:将2mL 菌液加入100mL含1∞mglL氨节青霉素的LB培养基中;37't: 300r/min震荡摇菌过夜;用威格拉斯大提质粒试剂盒提取质粒。用新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80% - 90%时,取重组腺病毒载体质粒,用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转 染。转染6h后,更换新鲜的细胞培养液。每天观嚷细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆,呈葡萄状,并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。取→个能够容纳离心管架子的冰盒,放人干冰和酒精的混合物,打开恒温水浴锅至37't:,在干冰酒精及37't:水浴反复冻融3次后, 3000r/min离心5min,收集含病毒的上清液,弃沉 淀。该上清即为第1代毒种(PI),作为随后大量病毒扩增的毒种。从PI代取病毒上清液感染、扩增、收毒及- 80't:保存待用。依据前面的冻融方法,冻融3次,取上清进行下一代扩增或于一80't:保存。以后每代的病毒扩增及收毒都如此反复进行。

1.6转染条件的优化:以不同的pAdxsi - GFP-SLC7A8病毒浓度转染6孔板NRK -52E细胞(空 白对照组、2?U2?L组(含约O. 5 x 106PFU/mL)、4?U4?L组(含约1 x 106PFU/mL)、6?ν6?L组 (含约2 x 106PFU/mL), 48h后通过流式细胞仪(flow cytometry)来检测转染效率。

1.7 RT一PCR检测转染后SLC7A8 mRNA的表达 水平:用最适感染复数(optimal multiplicity ofinfection, MOl)值浓度的重组腺病毒载体转染细胞 (NRK -52E)48h后,搜集各组细胞,TRIZOL法常规 提取各组总RNA,经Dase I消化去除基因组DNA污染。逆转录成eDNA,以此eDNA为模板,进行PCR扩增,GAPDH(产物大小309bp)为内参照。

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