本文是一篇专业的医学论文，主要是对高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙片的溶出度的阐述，详情请看下面的介绍。
我国于2000年批准进口立普妥，至今国内已有多个企业获得仿制药物的生产许可，同时还有包括国外仿制药企业在内的多个生产商提出了上市许可。
目前，国内外均批准了不同晶型的阿托伐他汀钙制剂上市应用。在口服固体制剂的研制中，通过溶出曲线，可直观反映药物的体外释放速度和程度。借助溶出曲线评价体系，可指导处方筛选，避免研制工作的盲目性，还可提高体内生物等效性试验的成功率[2]。因此在仿制药研制过程中，对溶出曲线的评价日益受到各国药监部门的关注与重视。
参考阿托伐他汀钙片国家药品标准[3-4]溶出度测定方法，目前采用的的方法为紫外分光光度法。溶出度检查条件和限度一致（900 ml水，50 r/min，30 min的限度为80%）。紫外分光光度法的专属性差，可能受到辅料（如可能对不同规格的制剂使用不同颜色的薄膜衣着色剂）的干扰，并且不能区分可能存在的降解产物。美国药典35版中收载了HPLC法测定阿托伐他汀钙含量的分析方法[5]，但一份样品时间长达2 h，不适合进行批量样品的溶出度分析。本文的目的是研究建立一种高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙片剂的分析方法，达到快速、准确、专属性高的目的。
1 仪器与试药
RC-6D药物溶出仪（上海黄海药检仪器有限公司），Waters Alliance高效液相色谱仪（沃特世公司，包括2695分离单元和2998二极管阵列检测器），AB265S电子天平（梅特勒-托利多公司），KQ-7000DV超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司），TGL-16G台式离心机（上海菲洽尔仪器有限公司）。
乙腈（色谱纯，Merck 61830025001730）、甲醇（色谱纯，Merck 1.06007）、磷酸（色谱纯，Honeywell，66129），整体化色谱柱Chromolith Performance RP-18e 100-4.6 （Merck），水为Mill-Q超纯水。
原研阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，批号111010K）购自药店，自制阿托伐他汀钙片由本校制剂室制备，阿托伐他汀钙对照品购自中国食品药品检定研究院（批号：100590-200802，纯度95.5%）。阿托伐他汀钙杂质A（脱氟物）对照品购自美国药典委员会，批号G0J255，含杂质A以游离碱计为92%；阿托伐他汀钙杂质D（乙氧基物）对照品购自美国药典委员会，批号G0J257，含相关物质D以游离碱计为86%。
2 方法
2.1 色谱条件
使用Merck Chromolith RP-18e整体化色谱柱（100 mm×4.6 mm），乙腈-0.1%磷酸以2.0 ml/min的流速进行梯度洗脱：0～2 min，乙腈比例为35%；2～6 min，乙腈比例自35%线性变化至90%；6.1～8 min，保持乙腈比例为35%再次平衡；检测波长244 nm；柱温为室温，进样体积20 ?l。每份样品的分析时间为8 min。
2.2 专属性
进行了3项实验以验证分析方法的专属性，以二极管阵列检测器记录的三维色谱图，通过色谱工作站的峰纯度判断阿托伐他汀钙峰是否存在干扰。
取空白辅料约20 mg，加溶出介质500 ml，超声（250 W，40 kHz） 30 min，冷却后离心分离上清液，照2.1中的色谱条件进样测定，空白介质和辅料对阿托伐他汀钙色谱峰（约4.7 min）没有干扰（图1）。
分别取阿托伐他汀钙对照品，阿托伐他汀钙杂质A对照品和杂质D对照品，用甲醇制成含阿托伐他汀钙约20 ?g/ml，含杂质A和杂质D各约0.4 ?g/ml的混合溶液，照2.1中的色谱条件进样20 ?l，杂质A和杂质D对阿托伐他汀钙色谱峰（约4.7 min）没有干扰（图2）。
取阿托伐他汀钙的甲醇溶液（1 mg/ml），分别用0.1 mol/L氢氧化钠、0.1 mol/L盐酸和30%过氧化氢溶液稀释1倍；另取部分水溶液，分别在85℃水浴中放置8 h和10 000 Lux照度下强光照射24 h，照2.1中的色谱条件进样20 ?l，可见阿托伐他汀钙在强酸、氧化剂和强光照射下出现明显的降解，降解产物对阿托伐他汀钙色谱峰（约4.7 min）没有干扰（图3）。
酸水解和加热水解产物的保留时间分别约为5.08 min和5.52 min，氧化产物约在2.52 min和3.04 min，光照降解产物在约7.68 min洗脱。
专属性实验的结果显示，在选定的色谱条件下，空白辅料和主要的已知降解杂质（脱氟物杂质A和乙氧基物杂质D）均对阿托伐他汀钙的测定没有干扰；阿托伐他汀钙在强酸、氧化剂和高温条件下的降解产物对阿托伐他汀钙的测定也没有干扰。
2.3 标准曲线
在相当于标示量10%～400%溶出率的范围（约0.9～40 ?g/ml）内进行了7个浓度水平的线性范围考察。以浓度C （?g/ml）～峰面积绘图，通过相关系数（r）、Y轴截距（b相当于低浓度峰面积的百分比）和残差图进行评价，结果显示，采用高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙片溶出液，在相当于标示浓度10%～400%的范围内呈现典型的线性关系，回归方程Y（峰面积）=25 549XC-1 368，相关系数r=0.999 998 （n=7）， Y轴截距相当于低浓度峰面积的5%，各数据点的残差为典型的离散分布。验证了使用HPLC法测定阿托伐他汀钙，响应值与浓度之间为线性关系。
2.4 检测限和定量限
取相当于10%溶出率的标准溶液（约0.944 μg/ml ）连续进样6次，峰面积的相对标准偏差为0.5%，可以达到稳定积分。取相当于10%溶出率的标准溶液用水稀释20倍后再次进样，积分面积1 108，峰高约相当于基线噪音的3倍，即小检测限约为标示量的0.5%。
2.5 回收率
在约70 ?g/ml、90 ?g/ml和11 ?g/ml 3个浓度水平（以标示量计，分别相当于溶出率的60%、80%和100%）进行了基于空白辅料的模拟溶出回收率实验，对照品和空白辅料加入溶剂（溶剂是以重量法定量加入的）后超声30 min，冷却后离心处理，外标法测定加入量。表1给出了3个浓度水平各3份溶液的测定结果。
2.6 精密度
溶出度检查的测定对象是单位制剂，而制剂单元之间的含量差异限度远大于分析方法的误差，因而精密度的考察是以同一分析批内的对照品溶液重复进样而测定的。此外，在溶出曲线的测定结果中，20 min后（平均溶出率超过90% ）的同批次片剂，溶出度测定结果间的差 ≤5%。显示HPLC法的精密度可以满足测定的要求（表2）。
2.7 溶出液的稳定性
考虑到溶出度的测定中，采用选定的色谱条件，单一样品的分析时间很短，一个批次样品的溶出度可在数小时内完成，溶出曲线分析也可以在一个工作日内完成，因而仅在研究的早期进行了24 h内溶出液稳定性的考察（表3）（样品在室温环境下密封放置于自动进样器托架上）。
供试品的溶出液在室温条件下均可稳定放置至少24 h。
2.8 滤膜吸附验证
在研究中，制备了模拟的溶出度溶液，将3个片剂分别置入3个装有900 ml水的三角瓶中超声处理，取部分模拟溶出液，一半进行离心处理，另一半使用13 mm的0.45 ?m水系滤膜（PES）进行3次顺序过滤，弃去0.5 ml初滤液后收集后3次滤液，每次1.0 ml，将3次的滤液和离心后的上清液分别采用USP 35版分析方法中的色谱条件进样测定。在3次实验中，9份滤液的峰面积与离心液的峰面积比值均在99.0%～102.0%之间，可以认为PES滤器对阿托伐他汀钙的溶出液不存在吸附，溶出液可以采用PES滤器过滤的方法处理。
3 测定结果
参照阿托伐他汀钙国家标准溶出度测定方法和中国药典2010年版二部溶出度测定方法[6]，进行溶出曲线的测定。分别考察了在水、0.1 mol/L盐酸溶液，pH 4.5和pH 6.8磷酸盐缓冲液中的溶出曲线。
在桨法每种介质的实验中，介质体积900 ml，介质温度37.5 ℃，转速5 r/min。测定前经过煮沸脱气，待恒温后投入片剂，自片剂接触溶剂时开始计时；分别在第5、10、15、20、30、45 min时停止转桨，从每个溶出杯中分别吸取溶液2 ml，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为供试品溶液。
精密称取阿托伐他汀钙对照品约25 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度；精密量取1.0 ml，置100 ml量瓶中，分别用相应的溶出介质稀释至刻度，作为对照品溶液。
按照阿托伐他汀钙国家标准溶出度测定方法[3]，分别取供试品溶液和对照品溶液，在241 nm的波长处测定吸收度，计算每片的溶出量。另取部分溶出液，照2.1中的色谱条件进样，以阿托伐他汀峰的峰面积外标法计算每片的溶出量。表4是分别采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定的自制片剂溶出曲线数据。
HPLC法得到的结果与紫外分光光度法相当，而15 min后的测定结果离散小，显示了更高的精密度。
图4是采用高效液相色谱法测定的原研片剂和自制片剂在水、pH 4.5或pH 6.8磷酸盐缓冲液中的溶出曲线。
4 讨论
新开发的高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙片溶出度的分析方法通过了方法学验证。相比于现行国家标准中的紫外分光光度法，具有更高的专属性，这体现为HPLC法可以分离潜在的降解产物，并且得到精密度更高的测定结果。
自制的阿托伐他汀钙片和原研品在水（质控介质）、pH 4.5或pH 6.8缓冲液中，具有相同的体外释放特征，经比较具有相似的体外溶出曲线[7]。
阿托伐他汀在盐酸中迅速分解，产生至少两个主要的降解产物，HPLC法可以良好的分离杂质和活性成分。
研究结果显示，HPLC法具有比紫外分光光度法更高的专属性、灵敏度、准确度和精密度，可以排除辅料（如不同颜色的包衣层）和潜在的降解产物对阿托伐他汀钙口服制剂溶出度测定的干扰，适用于进行溶出曲线、溶出度的质控和不同处方产品的质量评价。
