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  金针菇 (Flammulina velutipes) 属担子菌亚门、金钱菌属,是一种食药兼用菌,含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、朴菇素等多种生物活性物质[1],具有较高的药用价值[2,3]。金针菇功能蛋白性蛋白诸如核糖体失活蛋白(robosome inactitating proteins,RIP)具有抗肿瘤、抗病毒、抗虫、抗真菌以及抗人免疫缺陷病毒(HIV) 等活性;
  真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory proteins,FIP) 具有抗癌、抗过敏、抗增殖、刺激免疫细胞产生多种细胞因子和免疫调节功能;金针菇毒素(flammutoxin,FTX) 具有引起哺乳动物红细胞裂解,使肿瘤细胞溶胀破裂,改变肠上皮细胞的渗透性,促进药物吸收等作用[4-8]。
  近年来,金针菇中另一种重要的生物活性物质即金针菇多糖(polysaccharides of Flammulina velutipes,FVP)也引起人们的关注。研究发现,金针菇多糖有抗肿瘤[9-11]、免疫调节[12,13]和一定的保肝作用[14,15]。CCl4是一种常见的环境污染源和肝脏毒性物质,CCl4肝损伤是经典的急性化学性肝损伤动物模型,也是目前肝病研究的重要模型之一。本实验通过建立CCl4小鼠急性肝损伤模型,进一步探讨金针菇多糖对肝损伤的保护作用。
  1 材料与方法
  1.1 药物与试剂 金针菇多糖(FVP)提取物由广州农业科学院提供;联苯双酯滴丸(BDP),广州星群药业股份有限公司,生产批号:EF40131;谷丙转氨酶(ALT)、 谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,批号分别为:20070713,20070713,20080513,20080513。
  1.2 动物 昆明种小鼠,雄性,体质量(20±2) g,由南方医科大学动物中心提供,合格证号: SCXK(粤)2003?2002,饲养温度(23±2) ℃,饲养1周后进行实验。
  1.3 仪器 3?18K型台式高速离心机(Sartorius,Germany);MK3型酶标仪(Labsystem,Helsinki,Finland);BS210S电子分析天平 (Sartorius,G?ttingen,Germany);WH?861型漩涡混合器(太仓市科教器材厂);pH S?25型酸度计(上海伟业仪器厂);ULTRA?TURRAX T8型组织匀浆机(IKA Labortechnik,Staufen,Germany);WH?861型漩涡混合器(太仓市科教器材厂)。
  1.4 方法
  1.4.1 CCl4急性肝损伤的造模时间 将小鼠随机分成5组,每组10只,分别为:正常对照组、急性肝损伤组1(造模时间为12 h)、急性肝损伤组2(造模时间为24 h)、急性肝损伤组3(造模时间为48 h)、急性肝损伤组4(造模时间为72 h)。各急性肝损伤组均腹腔注射CCl4橄榄油溶液(0.5%,5 mL·kg-1),并分别于造模后12 h、24 h、48 h、72 h乙醚麻醉并心脏取血。正常对照组则腹腔注射等体积的橄榄油后乙醚麻醉取血。用赖氏法测定血浆ALT水平,对比各时间点ALT值随时间的变化关系以确定最佳造模时间。
  1.4.2 小鼠急性肝损伤模型的建立 将小鼠随机分成6组,每组10只:正常对照组、模型组、阳性药组(联苯双酯150 mg·kg-1)、低剂量组(75 mg·kg-1)、中剂量组(150 mg·kg-1)、高剂量组(300 mg·kg-1)。除空白对照组外,其余各组均每日灌胃1次,连续8 d,第7天下午模型组和给药组腹腔注射CCl4橄榄油溶液(0.5%,5 mL·kg-1),正常对照组则灌胃给同等体积蒸馏水和腹腔注射同等体积橄榄油。在造模期间,所有小鼠禁食不禁水。24 h后乙醚麻醉小鼠心脏取血和剥离肝脏。
  1.4.3 血浆ALT和AST活性的测定 小鼠全血置于肝素处理过的离心管中,以5 000 r/min离心5 min分离血浆。采用赖氏法[16],按照ALT试剂盒说明书中的步骤进行操作测定血浆ALT活性。
  1.4.4 肝脏SOD活性的测定 小鼠肝组织的5%生理盐水匀浆液在4 ℃条件下以10 000 r/min离心10 min,取上清液稀释成体积分数为2%后以考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。采用黄嘌呤氧化酶法[17],按照SOD试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝匀浆中SOD的活性。
  1.4.5 肝组织MDA含量的测定 小鼠肝组织的5%生理盐水匀浆液在4 ℃条件下以10 000 r/min离心10 min,取上清液稀释成体积分数为2%后以考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。采用TBARS比色法[18],按照MDA试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝组织匀浆中MDA的含量。
  1.5 统计学处理 实验数据以(±s)表示,采用SPSS软件,利用ANOVA检验进行统计学处理,P< 0. 05有统计学意义。
  2 结果
  2.1 CCl4急性肝损伤的造模时间 如表1所示,与正常对照组ALT (29.67±1.25) U·L-1相比,小鼠腹腔注射CCl4橄榄油溶液后,血浆ALT值随造模时间的变化而变化(12 h、24 h、48 h、72 h),其中造模24 h后ALT达最高值(117.87±11.86)U·L-1,而12 h和48 h (78.21±9.78,94.55±4.57) U·L-1相对正常组有升高,但比24 h低,72 h后ALT(40.01±9.12) U·L-1趋近正常小鼠血清ALT。
  2.2 金针菇多糖对急性肝损伤小鼠血浆ALT和AST的影响 如表2所示,与正常对照组相比,模型组小鼠血浆ALT和AST水平显着升高(P< 0.01),表明CCl4成功诱导了小鼠急性肝损伤。阳性药组和FVP各剂量组较模型组相比均有显着降低(P< .01),且呈剂量依赖性关系。
  2.3 金针菇多糖对急性肝损伤小鼠肝组织中SOD活性的影响 如表3所示,与正常对照组相比,模型组小鼠肝匀浆中SOD活性显着降低(P< 0.01)。与模型组相比,阳性药组和FVP各剂量组肝匀浆中SOD活性显着升高。
  金针菇多糖对急性肝损伤小鼠肝组织中MDA含量的影响 如表3所示,与正常对照组相比,MDA含量显着增加(P< 0.01)。与模型组相比,阳性药组和FVP各剂量组肝匀浆中MDA含量显着降低(P< 0.01),且呈剂量依赖性关系。表1 CCl4造模后血清ALT在不同时间点的变化表2 FVP对急性肝损伤小鼠血浆ALT和AST的影响与正常对照组比较: ##P<0.01;与模型组比较: *P<0.05,**P<0.01表3 FVP对急性肝损伤小鼠肝组织SOD活性和MDA含量的影响与正常对照组比较: ##P<0.01;与模型组比较:**P<0.01、
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