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沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建
目的 构建沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒表达载体.方法 查找人p 38MAPK cDNA序列,利用软件设计并合成能够形成互补双链并能转录出靶向人p38MAPK基因的 短发夹状RNA的两条寡核苷酸序列,退火后连接至线性化载体pSIREN上,获得重组质粒pSIRE N-p38MAPK,酶切和测序进行鉴定.结果 双酶切重组质粒获得特定的酶切图谱,证实所合成核酸片段的正确重组;测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同.结论 成功构建了沉默人p38MAPK基因的重组质粒pSIREN-p38MAPK.
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DOC-1R基因重组表达载体构建及其在HeLa细胞中的表达
目的 构建人DOC-1R基因重组逆转录病毒表达载体,实现该基因在体外培养细胞中的大量表达,从而研究表达蛋白的功能.方法 通过重组技术将含有FLAG标签序列的DOC-1RcDNA编码区全长克隆至逆转录病毒载体pLXSN,菌落PCR鉴定、限制性内切酶双酶切及测序验证重组载体的构建.将重组载体转染至GP-293细胞进行病毒包装并以所包装的病毒感染HeLa细胞,通过Western blot及间接免疫荧光染色检测重组DOC-1R蛋白的表达及细胞内定位.结果 测序结果表明重组载体中插入的重组片段序列及开放阅读框架正确,逆转录病毒表达载体pLXSN-FLAG-DOC-1R成功构建.Western blot及间接免疫荧光染色结果证实,逆转录病毒介导的重组DOC-1R蛋白在HeLa细胞中高效表达,表达效率明显高于真核表达载体介导的重组蛋白表达.结论 DOC-1R基因逆转录病毒表达载体成功构建,重组蛋白在体外培养细胞正确高效表达.
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胰腺癌反义K-ras癌基因片段的分离和克隆
目的:分离及克隆胰腺癌基因组中K-ras基因片段,构建重组反义K-ras癌基因逆转录病毒载体,并探讨其意义.方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI和EcoR I位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1及侧翼序列,并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN-Z中,并经菌液PCR和限制性内切酶酶切鉴定.结果:K-ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆人LZRSpBMN-Z中.结论:LZRSpBMN-Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一.应用PCR方法获取反义K-ras目的基因外显子1方便可行,可用于重组反义K-ras癌基因逆转录病毒载体的构建.
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含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备
目的:制备含野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒.方法:设计引物PCR扩增野生型p53cDNA,用T-A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109,提取pGEM-T/p53重组体,双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选pL(p53cDNA)SN重组体,脂质体法转染包装细胞AM12,G-418(geneticin)筛选,收集病毒液.结果:通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆,收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒.结论:含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究.
关键词： 野生型p53cDNA 逆转录病毒表达载体 -
AC133-2分子的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建
目的克隆人AC133-2全长基因,构建PGEZ-Tem-AC133-2逆转录病毒表达载体.方法采用分段克隆的方法,通过聚合链式反应从胎肝文库中克隆AC133-2,并构建AC133-2基因的逆转录病毒表达载体.结果成功克隆AC133-2全长基因并构建PGEZ-Term-ACl33-2逆转录病毒表达载体.结论AC133-2全长基因克隆及构建逆转录病毒表达载体的成功,为构建AC133-2转基因细胞和制备抗人AC133-2单克隆抗体和研究AC133-2的生物学功能奠定了物质基础.
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人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达
[目的]构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体,建立高表达bax基因的Hela细胞.[方法]通过RT-PCR方法从Hela细胞克隆bax基因,根据基因工程原理,经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBaxSN-IRES2-EGFP,转染Hela细胞后,荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况.[结果]成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体,并将其转入Hela细胞.[结论]成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株,为探讨bax基因与放射敏感性之间的关系奠定了基础.
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人生长激素基因逆转录病毒载体的构建
质粒pNMG3用EcoRI酶切,回收约3.9kb的小鼠金属硫蛋白启动子(mMT-1)和人生长激素(hGH)基因片段,将其亚克隆至逆转录病毒表达载体pLXSN的多克隆位点(MCS)中.对阳性重组子pLXSNhGH进行酶切鉴定,利用目的基因片段上的Bg/Ⅱ和载体pLXSN的多克隆位点中的BamHI酶切位点双酶切,正向重组子pLXSNhGH+应能产生约0.8kb和9.0kb2个片段;同时,应用巢式PCR鉴定目的片段,扩增片段大小为1.119kb,与预期结果相符,表明人生长激素逆转录病毒表达载体构建成功.人生长激素逆转录病毒表达载体的构建功为GHD基因治疗的进一步研究奠定了基础.
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mM-CSF 及其剪切体重组逆转录病毒表达载体的构建
目的：构建膜结合型M-CSF（ mM-CSF）及其胞内区截短30个氨基酸的剪切体（ mM-CSF-Δ）重组逆转录病毒表达载体。方法用DNA重组技术构建并鉴定mM-CSF和mM-CSF-Δ的重组逆转录病毒表达载体MSCV-PGK-GFP-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ，与空载体对照MSCV-PGK-GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒，并感染HEK293细胞，通过流式分选术获得3种阳性细胞。结果经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染HEK293细胞，获得了稳定表达细胞株HEK293-M、HEK293-M-Δ和对照细胞株HEK293-V。 RT-PCR以及West-ern blotting法检测发现HEK293细胞中有mM-CSF和mM-CSF-Δ的表达，HEK293-M细胞和HEK293-M-Δ细胞经流式抗体标记后均能检测到膜蛋白的表达。结论成功构建了mM-CSF及其剪切体的重组逆转录病毒表达载体。
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三价砷甲基转移酶基因在 UROtsa 细胞系的转导及表达研究
目的：构建人源三价砷甲基转移酶（ AS3MT）的基因逆转录病毒表达载体，转导UROtsa细胞，建立稳定表达的细胞系。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR），从人源HEK293细胞基因库中扩增出AS3MT基因，将AS3MT基因克隆到逆转录病毒表达载体pRetroX－IRES－ZsGreen1中，经病毒包装后，转导UROtsa细胞，荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达，采用流式细胞仪筛选阳性克隆，半定量RT－PCR法检测AS3MT mRNA表达水平，免疫印迹法检测AS3MT蛋白表达水平。结果经RT－PCR扩增AS3MT基因、限制性双酶切及基因测序鉴定，证实AS3MT基因正确插入逆转录病毒表达载体。以该载体转染病毒包装细胞RetroPack PT67后获得的病毒液滴度＞106 cfu／mL。将病毒转导UROtsa细胞，转导效率达50．00％。经3次流式细胞分选仪筛选，获得成功转染并稳定表达GFP的URO－RetroX－AS3MT细胞株；半定量RT－PCR和免疫印迹检测结果均表明所转导的AS3MT基因在UROtsa细胞中成功表达。结论成功构建能高水平稳定表达AS3MT基因的UROtsa细胞系，为研究AS3MT在砷的代谢、毒性和致癌性中的作用机制奠定基础。
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抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建
目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C) 基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C.方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定.结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确.结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C.
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抗肝癌sFv-TNF-α基因逆转录病毒包装细胞系的建立
目的:将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv-TNF-α)克隆至逆转录病毒载体pLXSN,包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系.方法:用平-粘末端连接方法将sFv-TNF-α克隆至pLXSN, 磷酸钙共沉淀法转染PA317包装细胞并测定病毒滴度, 用PCR及免疫组化方法分析鉴定重组逆转录病毒细胞系.结果:成功构建了表达载体pLXSN-sFv-TNF-α,筛选出一株 cfu＞1×109*L-1的感染性重组病毒产生细胞系C22.结论:外源基因整合到转染细胞DNA中并表达,证实了重组病毒的活性及其转导靶细胞的可行性.
