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mM-CSF 及其剪切体重组逆转录病毒表达载体的构建
目的：构建膜结合型M-CSF（ mM-CSF）及其胞内区截短30个氨基酸的剪切体（ mM-CSF-Δ）重组逆转录病毒表达载体。方法用DNA重组技术构建并鉴定mM-CSF和mM-CSF-Δ的重组逆转录病毒表达载体MSCV-PGK-GFP-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ，与空载体对照MSCV-PGK-GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒，并感染HEK293细胞，通过流式分选术获得3种阳性细胞。结果经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染HEK293细胞，获得了稳定表达细胞株HEK293-M、HEK293-M-Δ和对照细胞株HEK293-V。 RT-PCR以及West-ern blotting法检测发现HEK293细胞中有mM-CSF和mM-CSF-Δ的表达，HEK293-M细胞和HEK293-M-Δ细胞经流式抗体标记后均能检测到膜蛋白的表达。结论成功构建了mM-CSF及其剪切体的重组逆转录病毒表达载体。
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稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立
目的建立稳定高效表达正反义Alu-Sx的细胞系.方法根据Alu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A中构建成重组体.经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达强的亚克隆.结果成功构建Alu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆.结论高效稳定表达正反义Alu Sx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究.
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人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立
目的 构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达.结果 构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的 基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础.
