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大剂量甲氨蝶呤联合L-门冬酰胺酶治疗成人难治或复发急性淋巴细胞白血病
目的探讨大剂量甲氨蝶呤(MTX)与L-门冬酰胺酶(L-Asp)联合化疗对成人难治或复发急性淋巴细胞白血病(ALL)的疗效及毒副作用.方法难治或复发成人ALL患者分别为8例和6例,分别接受MTX 1 g/m2,静脉滴注,持续12 h;L-Asp 1万U/次,每天或隔天1次,共10次.结果 13例可评估患者中8例(61.5%)获完全缓解, 3例(23.1%)部分缓解,总有效率达84.6%;中位缓解期和中位生存期分别为11个月和9个月.无明显骨髓抑制,肝功能损害较常见但轻微,无一例患者于化疗期间死亡,无过敏及胰腺炎等严重副作用发生.结论大剂量MTX与L-Asp联合化疗方案作为成人难治或复发ALL的再诱导治疗缓解率高,耐受性好,疗效肯定.
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单甲氧基聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶的研究
用一种单甲氧基聚乙二醇修饰剂修饰L-门冬酰胺酶,初步确定了佳修饰条件,应用阴离子交换色谱和分子筛色谱分离纯化得到单修饰产物,酶活性回收率在40%以上,修饰产物的稳定性提高,免疫原性显著下降.
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C端融合RGD三肽的重组L-门冬酰胺酶基因克隆、表达和对血液系统的影响
利用加端PCR技术构建asnB-RGD工程菌,获得C末端带有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)三肽的门冬酰胺酶(AnsB-RGD),以改进L-门冬酰胺酶的作用.以pUA18为模板,利用pUC18上游普适引物和根据L-门冬酰胺酶Ⅱ基因(ansB)C末端下游序列设计的引物来扩增目标基因.将目标基因连于pMD18-T载体,转化宿主菌JM109,筛选出的阳性克隆通过HindⅢ、NcoⅠ双酶切下目标基因连到含T7启动子的高效表达载体pET28a上,再转化BL21宿主菌.高效表达的工程菌摇瓶发酵,渗透休克法提取AnsB-RGD融合蛋白,12%的SDS-PAGE检测酶蛋白并考察酶的活力、特异性及其对血液系统的影响.2%琼脂糖凝胶电泳、DNA测序鉴定构建的pET28a-ansB-RGD工程菌,奈氏法、SDS-PAGE及免疫学方法检测AnsB-RGD融合蛋白.DNA序列分析证明RGD三肽已经连接在L-门冬酰胺酶的C末端,带有RGD三肽的融合蛋白仍然能与抗L-门冬酰胺酶的抗体结合,初步发现AnsB-RGD融合蛋白有促进血液凝固作用,但酶活力下降.
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聚乙二醇醛(mPEG-ALD20000)对L-门冬酰胺酶化学修饰的初步研究
研究L-门冬酰胺酶的单甲氧基聚乙二醇醛化学修饰及纯化方法.以SDS-PAGE分析产物的单修饰产率,对反应的摩尔比,反应的pH值和反应时间和温度修饰条件进行优化,初步确定佳修饰条件为L-ASP与mPEG、ALD反应摩尔比是1∶10,反应pH值为5.0,在4℃下反应32 h.离子交换和分子筛联用对产物进行分离纯化,修饰产物活性残留达36%.修饰产物结构没有明显变化,活性得到很好的保留.
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重组L-门冬酰胺酶的聚乙二醇化学修饰及修饰后酶的稳定性研究
目的单甲氧基聚乙二醇(mPEG)化学修饰大肠杆菌重组L-门冬酰胺酶(L-ASP),考察经过修饰的酶的稳定性.方法N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化酯法活化mPEG,生成的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰琥珀酸亚胺酯(SSmPEG)按不同摩尔比例与L-ASP偶联,确定适合的反应时间和反应pH值.通过聚乙二醇化学修饰后的酶(L-ASP-PEG),酶活力和纯度通过奈氏法和丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,高效液相色谱检测L-ASP-PEG相对分子质量并考察了L-ASP-PEG体外稳定性等.结果SDS-PAGE显示mPEG已经偶联到L-ASP分子上,以两者摩尔比10:1为佳,反应pH条件为8.5,获得的L-ASP-PEG平均比活单位为64.8IU/mg,相对分子质量为301 800,体外稳定性高于L-ASP.结论此实验确定了mPEG化学修饰L-ASP佳反应条件为25℃反应30 min,两者投料摩尔比为10:1,获得的L-ASP-PEG比L-ASP稳定性高.
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工业化生产L-门冬酰胺酶发酵条件的研究
目的探讨不同发酵条件对L-门冬酰胺酶生产发酵的影响.方法对发酵罐的高径比、搅拌器转速、通气量及初始pH值等控制因素进行研究.结果及结论增加罐体高径比值,提高搅拌速度,提高发酵通气量及适当的初始pH值是提高L-门冬酰胺酶发酵的有效途径.
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L-门冬酰胺酶突变体的构建及其活性测定
目的:将L-门冬酰胺酶抗原表位区域的两个肽段作为突变对象,构建9个突变体,并对其酶活力和蛋白表达量与原酶进行比较研究.方法:根据丙氨酸扫描原理,应用重叠延伸PCR技术构建突变体,并对突变菌株进行基因测序和酶活力测定.结果:构建成功的突变菌株均具有酶活力,且蛋白表达水平不受影响.结论:首次采用基因修饰,改变L-门冬酰胺酶抗原表位区域的肽段,而不影响其酶活力,为后续研究和探讨L-门冬酰胺酶抗原表位结构与功能的关系提供了基础.
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侵袭性NK细胞白血病1例报告并文献复习
侵袭性自然杀伤(NK)细胞白血病(ANKL)是临床罕见、预后凶险的白血病类型之一,文献中缺乏大宗临床报道.我院新近诊治1例,经治疗后获得血液学缓解,已经生存9个月以上.现收集临床资料结合文献复习报告如下.
关键词： NK细胞 白血病 L-门冬酰胺酶 Hyper-CVAD -
L-门冬酰胺酶的稳定性研究
目的 探讨临床配制L-门冬酰胺酶(L-ASP)注射液时出现浑浊的原因及解决办法.方法 用5%NaHCO3注射液调整L-ASP注射液pH值,观察不同PH下输液的外观及不溶性微粒数的变化.结果 L-ASP注射液出现浑浊的原因在于溶媒pH值的不合理,用5%NaHCO3调整溶媒pH值为7.5时L-ASP静脉注射稳定.结论 此方法简便,价格低廉,有推广价值.
