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绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的：构建与鉴定携带绿色荧光蛋白标记的人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因的重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP。方法将hVEGF165基因进行扩增，并同源重组入表达质粒pAV-MCMV-HA-P2A-GFP，转化入DH5a感受态细胞，得到的转化子经菌落聚合酶链反应（PCR）鉴定和测序鉴定后，通过 Ad Max 腺病毒包装系统转染HEK293细胞，进行病毒的包装和扩增。包装后镜下观察HEK293细胞，测定腺病毒滴度，Western blot检测重组腺病毒的表达。结果成功构建了重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP，重组腺病毒转染的HEK293细胞出现了明显的细胞病变效应；获得重组腺病毒的滴度为1.106×108 IFU/mL；Western blot检测重组腺病毒表达在23000左右。结论成功获得重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-GFP，为进一步研究基因治疗脓毒症/感染性休克奠定了实验基础。
关键词： 人血管内皮生长因子165 腺病毒 载体构建 -
携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达
背景:已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道.目的:构建携带人血管内皮生长因子165 基因的慢病毒载体,体外转染BLR 3A 大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165 基因的表达.方法:采用DNA 重组技术将人血管内皮生长因子165 基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO 慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix 共转染293T 细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165 基因的慢病毒载体体外转染BLR 3A 大鼠肝细胞72 h 后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot 法检测细胞中人VEGF165 mRNA 及蛋白的表达.结果与结论:成功构建了表达人VEGF165 基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×107 VP/mL.重组慢病毒载体转染BLR 3A 大鼠肝细胞72 h 后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Westernblot 法测得转染组人血管内皮生长因子165 mRNA 及血管内皮生长因子165 蛋白表达阳性.提示构建的携带人血管内皮生长因子165 的慢病毒载体可有效转染BLR 3A 大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165 mRNA 及蛋白.
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脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞
目的:构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,通过脂质体法将其转入人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)中,鉴定hVEGF165的表达活性及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人白血病细胞HL-60中扩增出hVEGF165的基因片段,构建pIRES2-EGFP-hVEGF165重组质粒,经酶切检测其构建的正确性,通过脂质体法转染HPMSCs后分别采用RT-PCR、Western blotting法及MTT法检测其转录和表达活性；荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP),检测含有报告基因EGFP空载体及携带报告基因和目的基因的真核表达载体转染靶细胞的情况；并再次鉴定转染后HPMSCs的多向分化潜能.结果:成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165; RT-PCR、Western blotting及MTT法检测表明,构建的质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165具有转录及表达活性；绿色荧光显微镜下观察到EGFP表达,目的基因成功转入靶细胞,携带目的基因的HPMSCs仍保持多向分化潜能.结论:成功构建具有表达活性的hVEGF165真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,hVEGF165在HPMSCs中具有转录及表达活性,且对HPMSCs的增殖具有促进作用；HPMSCs本身可能具有hVEGF165的内分泌功能.
关键词： 人血管内皮生长因子165 人胎盘源间充质干细胞 脂质体 转染 -
低氧反应元件对缺血心肌转导hVEGF165基因表达的调控
目的 探讨低氧反应元件(hypoxic response element,HRE)对缺血、复灌心肌转导人血管内皮生长因子165(human vascular endous growth factor 165, Hvegf165)基因表达的调控作用.方法 在猪冠状动脉回旋支起始处以钛夹阻断回旋支血流,建立可复灌的心肌缺血模型.携带9拷贝HRE(9HRE)-Hvegf165的腺相关病毒转染模型心肌,转染后4天,复灌组二次开胸打开钛夹恢复缺血区血供.取各组心肌组织,RT-PCR法测定hVEGF165mRNA的表达情况;免疫组化及免疫印迹法测定Hvegf165蛋白的表达情况;Ⅷ因子免疫组化染色检测局部毛细血管情况.结果 缺血心肌转导Hvegf165基因后,Hvegf165蛋白表达量明显增高,而复灌组表达明显减少(P＜0.01).结论 9HRE作为调控缺血心肌组织内转导的Hvegf165基因的氧敏感开关灵敏、高效,使Hvegf165基因在缺血时高度表达,而复灌后表达水平下降.
关键词： 低氧反应元件 基因调控 人血管内皮生长因子165 腺相关病毒 心肌
