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二亚硝基哌嗪(DNP)对人细胞色素P450 2E1体外表达的影响
目的建立人细胞色素P450 2E1(CYP2E1) cDNA体外异源表达模型,观察化学致癌物二亚硝基哌嗪(N,N'-dinitrosopiperazine, DNP)对CYPWE1表达的影响.方法脂质体介导转染法将外源人CYP2E1 cDNA导入NIH3T3细胞,PCR和Southern blot鉴定外源基因的整合,RT-PCR检测其表达;用不同浓度乙醇和DNP处理转化细胞,RT-PCR和western bloting检测CYP2E1表达的改变.结果获得二个具外源基因CYP2E1 cDNA整合及稳定表达的细胞克隆NIH3T3-2E1-A1和NIH3T3-2E1-A8;经乙醇和DNP处理的细胞克隆CYP2E1 mRNA和蛋白质水平的表达增强.结论 DNP与乙醇对CYP2E1表达的诱导可能与其mRNA转录增强有关,DNP致癌可能与CYP2E1对其原位代谢活化相关.
关键词： 二亚硝基哌嗪 细胞色素P4502E1 基因表达 -
SILAC技术研究DNP对鼻咽癌细胞株6-10B蛋白质组的影响
目的 应用细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)结合生物质谱分析的方法,分析二亚硝基哌嗪(DNP)对6-10B细胞蛋白质表达的影响,并鉴定与转移相关的蛋白质.方法 利用SILAC标记6-10B细胞,得到“重标”的6-10B细胞,经DNP处理24 h后提取细胞总蛋白,与未经DNP处理的“轻标”细胞中提取的总蛋白等量混合,酶解肽段,经正交反相色谱分离后用质谱鉴定,对数据进行定性和定量分析.结果 共鉴定到2 853个蛋白质,其中172个表达上调,199个表达下调.筛选其中5个与肿瘤转移相关的蛋白质,进行Western blotting验证,证明SILAC定量结果的正确性.通过GO进行分析,从生物过程、细胞定位和分子功能3个方面对差异蛋白进行注释.结论 建立了利用SILAC技术研究宿主细胞-化学药物相互作用的方法,发现了DNP处理细胞的关键蛋白质,为探索DNP致鼻咽癌转移的分子机理提供了实验基础.
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二亚硝基哌嗪诱发SD大鼠鼻咽癌变中端粒酶和端粒酶RNA的表达
目的:端粒酶是一种反转录酶,由RNA和蛋白质组成的复合物,能以自身为模板催化合成端粒DNA,以弥补细胞有丝分裂时端粒的丢失,使得细胞无限地增殖,呈永生化.端粒酶激活与肿瘤的发生密切相关.研究证明,端粒酶的激活是肿瘤发生的早期事件,细胞的恶性改变依赖于端粒酶的激活研究.二硝亚基哌嗪(DNP)为一间接致癌物,不仅可在体内诱发大鼠鼻咽癌,而且可诱发体外培养的人胚鼻咽上皮细胞恶性转化,其致癌作用可能与DNA 损伤和基因突变有关.方法:采用二硝亚基哌嗪(DNP)诱发大鼠鼻咽癌,研究鼻咽癌变过程中端粒酶的表达规律以阐明DNP诱癌的部分机制.在病理学检测DNP诱导大鼠鼻咽癌不同阶段鼻咽上皮变化的同时,用ELISA-PCR和Nested RT-PCR检测其端粒酶和端粒酶RNA的表达.结果:DNP诱导大鼠鼻咽癌过程中,端粒酶活性不断升高,端粒酶的活性与所给DNP诱导剂量无关,端粒酶的变化与鼻咽癌癌变过程呈正相关,而且端粒酶RNA表达先于端粒酶的表达.在大鼠鼻咽上皮癌变异型增生阶段即出现端粒酶的激活和端粒酶RNA的表达.结论:进一步证实DNP诱导鼻咽癌;同时发现化学致癌物能激活端粒酶和端粒酶RNA的表达;端粒酶的激活和端粒酶RNA的表达是鼻咽上皮癌变的早发事件,DNP诱导大鼠鼻咽癌可能与其激活端粒酶有关.
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细胞色素p450 2E1基因在鼻咽组织中的表达及多态性分析
鼻咽癌(NPC)的化学病因主要涉及亚硝胺类化合物,这类物质需经体内细胞色素p450 2E1(CYP2E1)等酶代谢活化后方具致癌潜能.我们曾单独用二亚硝基哌嗪(DNP)体外诱导人鼻咽上皮细胞,获得恶性转化表型,而对DNP的活化过程却不明确.方法和结果:采用RT-PCR和Western blot方法检测了正常鼻咽上皮细胞,首次发现CYP2E1在鼻咽部的表达,提示DNP在体外作用于鼻咽细胞后可能被CYP2E1代谢活化而致细胞癌变,为NPC的化学病因提供了重要证据.另有研究提示在CYP2E1基因上游5'-侧端区调控序列具有Rsa Ⅰ和PstⅠ限制性内切酶片段长度多态性(RFLP),且与肺癌的遗传多态性有关,为揭示该多态性与鼻咽癌易感性之间的关系,我们采用PCR-RFLP方法分析了105例鼻咽癌患者和93例正常人体细胞CYP2E1基因型.结果发现Rsa Ⅰ和PstⅠ识别的CYP2E1基因纯合子突变型(C2/C2)在鼻咽癌人群为5.7%,显著高于正常人群(1.1%)分布(χ2＝4.86, P＜0.05);携带C2/C2基因型个体发生鼻咽癌的危险性比携带其它基因型个体高5倍左右.结论:我们认为CYP2E1基因的多态性可能是鼻咽癌易感的因素之一.
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二亚硝基哌嗪上调鼻咽癌细胞HSP70鄄2的表达及其意义
目的：分析二亚硝基哌嗪（dinitrosopiperazine，DNP）对鼻咽癌细胞热休克蛋白70-2（heat shock protein 70-2， HSP70-2）表达的影响，探讨DNP调控鼻咽癌细胞HSP70-2表达的意义和机制。方法以HSP70-2低表达的低转移潜能鼻咽癌细胞6-10B为实验对象，用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tertrazolium，MTT）法检测DNP对6-10B细胞的非毒性浓度；分别采用细胞间接免疫荧光法、Western blot法和RT-PCR技术检测分析DNP对6-10B细胞HSP70-2表达的影响。结果 DNP对鼻咽癌6-10B细胞的非毒性浓度为0~100μmol/L。经DNP处理6-10B细胞后，HSP70-2蛋白的表达显著增强，主要表达在细胞质。HSP70-2蛋白的表达与DNP处理的浓度呈剂量效应关系（P<0.05）。DNP（50μmol/L、100μmol/L）处理组HSP70-2 mRNA的表达水平与未处理组的表达无明显差异（P>0.05）。结论 DNP可能通过转录后调控机制上调鼻咽癌细胞HSP70-2蛋白的表达，推测DNP调控HSP70-2蛋白的表达并在鼻咽癌发生、发展中起重要作用。
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二亚硝基哌嗪上调AGR2促进鼻咽癌细胞转移
目的:探讨二亚硝基哌嗪(DNP)通过调控AGR2表达参与鼻咽癌转移的分子机制.方法:以具有低转移潜能的鼻咽癌细胞6-10B作为研究材科,应用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测DNP对6-10B细胞的非毒性浓度;分别采用间接免疫荧光法、Western blot和实时荧光定量PCR法检测DNP对6-10B细胞中AGR2蛋白及mRNA表达的影响;采用针对AGR2基因的特异性小干扰RNA(siRNA)沉默6-10B细胞AGR2的表达,并用Transwell小室法检测其对细胞侵袭和迁移能力的影响.结果:MTT法检测DNP对6-10B细胞的非毒性浓度为0～10.0 μmol/L;8.0 μmol/LDNP处理6-10B细胞后,间接免疫荧光法检测发现AGR2蛋白表达明显上调,且以在细胞质中表达为主;不同浓度的DNP处理6-10B细胞24 h或用8.0 μmol/L的DNP处理6-10B细胞不同时间后,Western blot结果发现AGR2蛋白的表达水平增加且呈浓度和时间依赖性(P＜0.05);siRNA-AGR2沉默6-10B细胞中AGR2基因的表达后,DNP诱导6-10B细胞的侵袭及迁移能力较干扰前明显降低(P＜0.05).结论:DNP可能通过在转录水平上调AGR2的表达,影响鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力.
