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羊膜干细胞对严重烧伤大鼠早期心肌损伤的保护作用
目的 探讨羊膜干细胞(AMSCs)对严重烧伤大鼠早期心肌损害的作用及相关作用机制.方法 采用酶消化法分离培养AMSCs,并用流式细胞仪对所分离培养细胞表面分子标志物进行检测,并进行体外诱导成脂、成骨分化鉴定.24只健康雄性SD大鼠,按照随机数字表法进行实验分组,分为单纯烧伤(burn)组、AMSCs组、假伤(sham)组.实验大鼠背部于98℃热水浴15 s,制成30％总体表面积Ⅲ度烧伤模型,伤后即刻burn组、AMSCs组大鼠分别腹腔注射0.9％氯化钠10 mL(50 mL/kg)行抗休克治疗,3h后两组大鼠分别经尾静脉注射PBS和AMSCs;sham组仅对大鼠背部于37℃水浴15 s,模拟烧伤模型制作过程.48 h后采集三组大鼠腹主动脉血及心肌组织标本,采用ELISA法检测乳酸脱氢酶(LDH)、血清肌酸激酶(CK)的含量,RT-PCR法检测组织中凋亡相关因子(cas-pase-3),炎性相关因子TNF-α、IL-1β及抑炎因子IL-10 mRNA表达水平.对所得实验数据进行单因素方差分析、LSD-t检验.结果 采用酶消化法培养的AMSCs传至第3代后检测均表达CD29、CD44、CD90、CD105,而CD34阳性率较低,可在体外向成骨成脂诱导分化.与sham组比较,burn组大鼠血清LDH、CK的含量显著增高(P＜0.05),AMSCs组CK、LDH含量与burn组相比显著降低(P＜0.05).burn组大鼠心肌中TNF-α、caspase-3、IL-1β mRNA水平均高于sham组(P＜0.05),AMSCs组心肌组织中TNF-α、caspase-3、IL-1β mRNA水平显著低于burn组(P＜0.05).burn组大鼠心肌组织中IL-10 mRNA表达量显著低于sham组(P＜0.05),AMSCs组大鼠心肌组织中IL-10 mRNA表达量与burn组比较显著增高(P＜0.05).结论 严重烧伤早期采用AMSCs治疗可显著降低心肌CK、LDH水平,减轻严重烧伤导致的心肌组织损伤,降低心肌细胞凋亡,减少炎症细胞因子IL-1β和TNF-α表达,促进抑炎细胞因子IL-10的表达水平,对严重烧伤大鼠心脏细胞损伤具有重要的保护作用.
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小鼠羊膜干细胞的分离与培养
目的 探索小鼠羊膜细胞(mAMCs)分离、培养方法及其体外增殖分化的特性.方法 应用不同浓度胰蛋白酶及与胶原酶按不同的先后顺序作用小鼠羊膜,并采用不同的细胞接种浓度培养细胞,分别考核佳的分离及体外培养方案.免疫荧光及免疫组化法鉴定mAMCs的干细胞标志.结果 胰蛋白酶消化及与胶原酶合用顺序不同,导致收获上皮细胞与间质细胞的数量和比例明显不同,先用胰蛋白酶消化将得到较多的上皮细胞,反之先用胶原酶消化将得到较多的间质细胞.以不同浓度接种上皮和间质细胞,原代培养2w后生长曲线可见原代培养的mAMCs在y轴为对数坐标时呈长尾s型曲线.原代培养的上皮和间质细胞有较长的停滞期(2～4 d),指数增长期的细胞倍增时间间质细胞相对上皮细胞短,因此融合期时间间质细胞明显较短.接种浓度对间质细胞的生长曲线影响不大,但对上皮细胞有较大影响.在Chang medium C营养液中原代附壁培养mAMCs OCT3/4及SSEA-1阳性.结论 应用0.25％胰蛋白酶及与0.075％胶原酶作用小鼠羊膜,可获得分离的mAMCs,原代培养mAMCs干细胞标志OCT3/4及SSEA-1阳性.
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羊膜干细胞用于修复损伤子宫内膜的动物实验研究
目的 通过使用羊膜干细胞修复损伤的小鼠子宫内膜实验,了解羊膜干细胞是否有助于子宫内膜的修复,为将来进一步应用于临床提供依据.方法 参照人羊膜干细胞方法先制备小鼠羊膜干细胞,再建立小鼠子宫内膜损伤模型,然后根据方法不同分为3组(造模组50只,假手术组20只,对照组20只).造模术后10 d取造模组10只,假手术组10只,对照组10只处死,肉眼观察宫腔改变,取出各组小鼠子宫置入中性甲醛固定,HE及Masson染色,对其进行纤维化半定量评分.各组再取10只小鼠与雄性小鼠合笼饲养,妊娠10 d开腹记数着床胚胎数作为评价生育能力指标.另外30只造模组行粘连分离后分别给予宫腔内注射羊膜干细胞、口服雌激素及空白.结果 模型组在造模后宫腔纤维化面积比例增加,腺体数量减少,妊娠能力明显下降,而假手术组及对照组无明显变化,造模组与假手术组及对照组相比,3项指标都有显著性差异(P＜0.05),对造模成功组采用不同治疗方案,结果显示,干细胞宫腔内注射可以改善宫腔纤维化面积及腺体数量,而雌激素无明显作用,3组治疗相比,干细胞组比其他组作用更明显,差异有显著性((P＜0.05).结论 宫腔粘连分离后注入羊膜干细胞有利于子宫内膜的修复.
