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葛根总黄酮对刀豆蛋白A诱导的小鼠免疫性肝损伤保护作用及其机制的初步研究
病毒性肝炎(viral hepatitis)是常见病、多发病,通过一系列的免疫应答可引起肝细胞损伤,其中以细胞免疫为主,特别是TNF-α大量释放,可导致肝脏急性出血性坏死[1].葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi.的干燥根,含多种黄酮类成分,具有解酒毒、降血脂等多种药理活性[2].本研究采用刀豆蛋白A诱导小鼠免疫性肝损伤模型,探讨葛根总黄酮(TPF)的保护作用,以期为葛根总黄酮在病毒性肝炎等免疫性肝损伤中的应用提供依据.
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晚期糖化终产物受体在小鼠急性肝损伤中的表达及意义
目的 探讨晚期糖化终产物受体(RAGE)在刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠急性肝损伤中的表达及意义.方法 将72 只昆明种小鼠随机分为对照(NS)组、ConA组,分别于注射后2、6、12、18、24、48 h眼球取血并留取肝脏标本,用赖氏法检测血清中谷氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活力;HE染色法检查肝组织病理学改变;RT-PCR技术检测肝组织高迁移率族蛋白1(HMGB1)、RAGE、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-lβ) mRNA的表达;免疫组化法检测肝组织HMGB1蛋白的表达;Western blot法检测肝组织RAGE蛋白的表达;ELISA法检测血清中TNF-α、IL-lβ含量.结果 成功构建ConA诱导小鼠肝损伤模型;注射ConA 2 h肝组织中HMGB1 mRNA表达即增加,至18 h达峰值(P<0.01);HMGB1蛋白表达明显聚集于坏死区域;肝组织RAGE mRNA于12 h表达上调;RAGE蛋白的表达于24 h达到峰值,与NS组相比差异有统计学意义(P<0.01);肝组织TNF-α mRNA表达分别在6、24 h出现2个峰值,血清TNF-α含量在注射ConA 2 h达峰值(455.25 ng/L),随后逐渐减低,至48 h与NS组相比无明显差异;注射ConA各时间点小鼠肝组织与血清中IL-1β水平均显著高于NS组(P<0.01).结论 在ConA诱导小鼠急性肝损伤模型中,损伤肝组织RAGE的表达显著增加,这可能与诱导肝组织损伤中炎症因子的进一步产生有关.
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美洲大蠊及其不同提取物对急性免疫性肝损伤保护作用的比较
目的探讨美洲大蠊及其不同提取物对刀豆蛋白A ( ConA)致小鼠急性免疫性肝损伤时肝脏功能的保护作用。方法将小鼠随机分为正常对照组、模型组、虫粉混悬(100、200 mg/kg)组、醇提取(100、200 mg/kg)组、水提取(100 mg、200 mg/kg)组、醇水双体取(100、200 mg/kg)组、联苯双酯200 mg/kg组。给予小鼠美洲大蠊原虫粉及其不同提取物灌胃10 d后,采用尾静脉注射ConA 20 mg/kg制备急性免疫性肝损伤模型,8 h后称取小鼠体重,眼球取血测定血清中丙氨酸氨基转移酶( ALT)、门冬氨酸氨基转移酶( AST)活性；处死小鼠取出肝脏和脾脏称重,计算肝脾指数；制备肝脏匀浆测定超氧化物歧化酶( SOD )、丙二醛( MDA )、谷胱甘肽( GSH)活性和HE染色下肝脏病理组织学变化。结果与模型组比较,给药组均有降低ConA致小鼠急性免疫性肝损伤肝脾指数(P<0.01,P<0.05)；降低血清中ALT、AST活性(P<0.01,P <0.05)和肝脏组织中 MDA 的活性(P <0.01,P<0.05)；升高肝脏组织中的SOD、GSH的活性(P<0.01,P<0.05)；减轻小鼠肝脏病理损伤。结论美洲大蠊及其提取物对ConA引起的小鼠急性免疫性肝损伤具有一定保护作用。美洲大蠊及其提取物存在药效差别,虫粉混悬组及水提取组作用优于其醇提取组和醇水双提取组。
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刀豆蛋白A引起小鼠免疫性肝损伤机制研究
目的:建立刀豆蛋白A(Con A)引起小鼠免疫性肝损伤模型,并考察其损伤机制.方法:ICR小鼠随机分为正常对照组和Con A模型组,每组10只.Con A模型组小鼠尾静脉注射Con A 2.5 mg·ml-1·kg-1,对照组给予等体积生理盐水.造模后8 h断头处死小鼠,分别取肝脏和血液,采用生化法测定小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转移酶(AST)水平,苏木精-伊红染色法测定肝组织病理学改变,ELISA法测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)含量.结果:与正常对照组比较,Con A模型组小鼠血清ALT和AST水平均显著升高(P＜0.01),肝细胞明显坏死,伴炎细胞浸润,同时血清中TNF-α和IFN-γ含量亦均显著升高(P＜0.01).结论:尾静脉注射Con A 2.5 mg·ml-1·kg-1可建立免疫性肝炎模型,其损伤机制与炎症因子表达相关.
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降钙素基因相关肽对急性肝损伤小鼠肝脏微循环的干预
目的:研究降钙素基因相关肽(CGBP)对刀豆蛋白A(Con A)诱导的小鼠肝损伤模型肝脏微循环的影响.方法:昆明种小鼠60只,随机分为Con A损伤组、CGRP干预组和空白对照组(n=20),空白对照组注射生理盐水,Con A损伤组用Con A诱导建立小鼠急性肝损伤模型,CGRP干预组在用Con A诱导建模前体外注射CGRP,各组中10只于处理后用激光多普勒血流仪测肝脏的平均血流灌注量,另10只活体观察肝脏微循环流速,后处死,全部HE染色观察肝脏病理变化.结果:CGRP干预组肝脏的平均血流灌注量和血液流速较Con A损伤组明显增加(P<0.01),病理学改变明显减轻.2组的血细胞浓度差异无统计学意义(P>0.05).结论:CGRP能够通过改变肝脏组织的灌注影响急性肝损伤时肝脏微循环障碍的程度和病理改变.
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褐藻胶寡糖对刀豆蛋白A诱导的急性肝损伤保护作用及机制初探
目的 研究褐藻胶寡糖对刀豆蛋白A (Concanavalin A,ConA)诱导急性肝损伤的保护作用及其可能的作用机制.方法 本实验以分子量为3 kDa的甘露糖醛酸寡糖(M-3k)和古罗糖醛酸寡糖(G-3k)为受试样品,通过检测ConA注射后14 h血清转氨酶水平及肝组织病理学评估肝脏损伤;通过酶联免疫法(ELISA)检测TNF-α、IL-6水平;Western Blottingting法检测Bcl-2、Bax蛋白表达.结果 与模型组相比,褐藻胶寡糖预防组显著降低了ConA急性肝损伤小鼠血清AST和ALT水平(P＜0.05),且组织病理学观察发现,肝细胞损伤、炎性浸润和凋亡程度减轻;与模型组相比,褐藻胶寡糖预防组显著降低了肝组织匀浆中促炎因子TNF-α、IL-6水平(P＜0.05);褐藻胶寡糖预防组Bcl-2蛋白表达明显高于模型组(P＜0.05),Bax蛋白表达水平明显低于模型组(P＜0.05).结论 说明褐藻胶寡糖对ConA诱导小鼠急性肝损伤具有一定保护作用,并且其作用机制可能部分与抑制肝脏炎症反应和干扰凋亡过程有关.
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刀豆蛋白A诱导的肝损伤中核因子-κB对诱导型一氧化氮合酶表达的调控及其意义
目的:研究核因子-κB(NF-κB)在刀豆蛋白A(Con A)诱导的免疫性肝损伤中的作用.方法:雄性BALB/c小鼠在注射Con A后1/2、1、4、8、16 h取其血清和肝脏,检测血清中谷丙转氨酶(ALT)与肝脏中NO的含量,用Western blotting法检测肝脏中IκB、NF-κB、iNOS蛋白水平的变化.结果:注射Con A后1/2 h,血清中ALT明显增高;Western blotting法显示,注射Con A 1 h,胞浆中IκB完全降解,胞核中NF-κB明显增加,胞浆中iNOS蛋白在注射Con A后4 h含量高;组织中NO含量在肝损伤4 h明显增高;病理学检测显示,Con A注射8 h后肝损伤严重.结论:在Con A诱导的肝损伤中,NF-κB通过诱导iNOS的产生,增加肝组织中NO的含量,诱导肝细胞损伤.
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P物质及其受体在小鼠免疫性肝炎中的作用
目的 观察P物质(SP)及其受体NK-1R介导的神经源性炎症在小鼠免疫性肝炎发病中的作用和可能机制.方法 小鼠尾静脉注射刀豆蛋白A(Con A)建立免疫性肝炎模型组,注射生理盐水作为对照组.HE染色观察肝脏病理变化;肝组织匀浆SP测定采用酶联免疫吸附(ELISA)法;同时应用RT-PCR法对各组动物肝脏组织中NK-1Rm-RNA的表达水平进行相对定量比较.结果 模型组肝脏损害严重,以肝细胞肿胀和免疫细胞浸润为特征;肝组织匀浆sP含量模型组(507.25±30.35)显著高于对照组(238.59±21.90)(P<0.01);而且模型组NK-1R mRNA的表达显著上调(P<0.05).结论 P物质及其受体参与了小鼠免疫性肝炎的起始阶段,并在炎症的激发和扩大方面发挥了重要作用.
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miR-20b对自身免疫性肝炎小鼠肝脏的保护作用及机制
目的 观察miR-20b对自身免疫性肝炎小鼠肝脏的保护作用,并探讨其作用机制.方法 将52只小鼠随机分成模型组16只、对照慢病毒组18只、miR-20b慢病毒组18只.模型组正常饲养,对照慢病毒组注射点突变miR-20b与靶基因结合的种子序列而构建得到对照载体,miR-20b慢病毒组注射miR-20b慢病毒表达载体.7d后三组均注射刀豆蛋白A(ConA)诱导自身免疫性肝炎.造模后6、12、18、24、36、48 h眼静脉采血,采用赖氏法检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平;造模后2h采用ELISA法检测血清炎症因子IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平;处死小鼠,取肝组织进行病理切片及HE染色,观察肝组织损伤情况;应用实时荧光定量PCR法检测肝组织中IFN-γ 、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表达.结果 模型组血清ALT水平于造模后6h开始升高,18h左右达峰值,48 h左右基本恢复.与对照慢病毒组相比,miR-20b慢病毒组血清ALT水平降低(P＜0.05);模型组与对照慢病毒组比较差异无统计学意义(P＞0.05).对照慢病毒组肝组织有一定面积的坏死区域,同时伴有炎症细胞浸润和肝实质细胞坏死;miR-20b慢病毒组仅有炎症细胞浸润,未见明显坏死区域.与对照慢病毒组相比,miR-20b慢病毒组血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平和肝组织中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表达水平均降低(P均＜0.05),模型组与对照慢病毒组比较差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 miR-20b在小鼠自身免疫性肝炎的病程中发挥一定的保护作用,其机制可能是通过抑制肝脏炎症反应从而减轻肝损伤.
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丹参总酚酸对刀豆蛋白A所致小鼠急性肝损伤的保护作用及机制
目的：研究丹参总酚酸对刀豆蛋白A（ ConA）所致急性肝损伤小鼠的保护作用及机制。方法将野生型C57BL／6（ B6）雄性小鼠随机分为正常对照组、丹参总酚酸组、ConA组和丹参总酚酸＋ConA组。 ConA组小鼠通过尾静脉注射ConA（40 mg／kg）诱导肝损伤；丹参总酚酸＋ConA组小鼠先经腹腔注射丹参总酚酸溶液（50 mg／kg），30 min后再给予相同剂量的ConA；正常对照组仅尾静脉注射生理盐水，丹参总酚酸组仅腹腔注射丹参总酚酸溶液，剂量同上。干预16 h后，采用全自动生化分析仪测肝功能，应用HE染色观察肝脏病理学变化，应用ELISA和Luminex方法检测细胞外组蛋白及相关炎症分子（ IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α）的水平。结果小鼠尾静脉注射Co-nA后发生了明显的肝损伤，表现为血浆ALT、AST水平显著升高，大量肝细胞凋亡坏死和炎症细胞浸润；给予丹参总酚酸干预能显著减轻小鼠肝损伤，降低ALT、AST水平。与正常对照组或丹参总酚酸组相比，ConA组的细胞外组蛋白、IL-1、IL-6、IL-18和TNF-α水平均升高（P均＜0．01）；与ConA组比较，丹参总酚酸＋ConA组小鼠各指标均降低（P均＜0．01），但仍高于正常对照组或丹参总酚酸组（P均＜0．01）。结论丹参总酚酸对ConA所致的小鼠急性肝损伤有显著保护作用，其机制可能与降低细胞外组蛋白和相关的细胞因子水平有关。
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刀豆蛋白A对CD4+CD25+调节性T细胞CCR4和CCR6表达的影响
目的 探讨刀豆蛋白A(ConA)对CD4+ CD25+调节性T细胞趋化因子受体4(CCR4)和CCR6表达的影响.方法 采用密度梯度离心法分离1名健康志愿者的外周血单个核细胞,免疫磁珠阴性分选法富集CD4+T细胞.采用流式细胞术分选出CD4+ CD25+调节性T细胞和CD4+ CD25-T细胞,并分析其纯度及存活率.采用20μg/mL ConA对细胞进行刺激,流式细胞术检测两种细胞刺激0、24、48 h的CCR4和CCR6表达.结果 流式细胞术分选CD4+ CD25+调节性T细胞的纯度为97.8％,CD4+ CD25-T细胞为90.1％,两种细胞存活率均＞90％.随着ConA刺激时间延长,CD4+ CD25+调节性T细胞和CD4+ CD25-T细胞CCR4表达均呈升高趋势,CCR6表达均呈先升高后降低趋势;ConA刺激0、24、48 h,CD4+ CD25+调节性T细胞CCR4、CCR6表达均高于CD4+ CD25-T细胞(P均＜0.01).结论 CD4+ CD25+调节性T细胞CCR4、CCR6表达均升高,经ConA刺激后CCR4表达呈时间依赖性.
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甘草酸铵通过抑制HMGB1的表达减轻ConA诱导的免疫性肝损伤
目的 探讨甘草酸铵对刀豆蛋白A( Concanavalin A,ConA)诱导的免疫性肝损伤的保护作用及其可能的分子机制.方法 在小鼠尾静脉注射ConA(20 mg/kg)前30 min,腹腔注射甘草酸铵(100 mg/kg).ConA注射后8h,检测血清转氨酶水平及肝组织学以评估肝损伤程度,应用酶联免疫法( ELISA)检测肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)水平.同时,分别采用实时荧光定量PCR和免疫组化检测肝组织高迁移率族蛋白-1(HMGB1) mRNA与蛋白的表达.结果 预防性应用甘草酸铵有效地保护ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤,表现为血清转氨酶水平与肝脏组织炎症坏死程度明显减轻；与ConA模型组相比,甘草酸铵对肝脏内的促炎症细胞因子TNF-α和IFN-γ并无影响,但增加了抗炎症因子IL-10水平(P＜0.01)；同时,甘草酸铵预防组肝组织HMBG1基因与蛋白的表达均明显低于模型组(P均＜0.01).结论 甘草酸铵有效改善ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤,其发挥作用的分子机制与抑制HMBG1表达有关.
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实验性急性肝损伤血清IL-18、NO的检测意义及作用机制研究
目的本实验以ConcanavalinA(ConA)诱发小鼠急性肝损伤模型,检测白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)及一氧化氮(Nitric oxide,NO)血清浓度变化.并探讨此模型中IL-18和NO的关系、意义及作用机制.方法用ABC-ELISA法及硝酸还原酶法分别检测了20只正常小鼠(对照组)及20只(实验组)小鼠6 h血清中IL-18及NO的浓度.结果实验组小鼠血中IL-18及NO较对照组均明显增高,差异有显著性.经直线相关分析,IL-18与NO呈显著相关性.结论IL-18在肝损伤中起关键作用,NO对肝损伤亦有重要作用,NO浓度随IL-18表达水平的变化而变化,两者对肝损伤既有独立又有协同作用.IL-18的浓度高低可用于判断肝损伤的严重程度及预后,IL-18使血清中NO水平升高是其致肝细胞损伤的机理之一.
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槲皮素对刀豆蛋白A诱导小鼠急性肝损伤的保护作用
目的：探讨槲皮素对刀豆蛋白A( Concanavalin A, ConA)诱导小鼠急性肝损伤的保护作用及其可能的分子机制。方法通过检测ConA注射后8 h血清转氨酶水平及肝组织病理学评估肝损伤；应用酶联免疫法( ELISA)检测TNF-α、IFN-γ、IL-4水平；定量PCR和Western blotting或免疫组织化学检测肝组织mRNA与蛋白的表达。结果与模型组相比,槲皮素预防组显著降低了血清转氨酶水平(P<0.05),且组织病理学分析表明肝脏炎症坏死程度明显减轻；与模型组相比,槲皮素预防组显著降低了血清促炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-4的水平(P<0.01)；槲皮素预防组肝组织NOX4、COX-2和iNOS基因与蛋白的表达均明显低于模型组(P<0.05)。结论槲皮素对ConA 诱导小鼠急性肝损伤具有保护作用,其发挥有益作用的机制可能与抑制肝脏的炎症反应有关。
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刀豆蛋白A条件化培养基对体外培养兔角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶的作用
目的 研究刀豆蛋白A(ConA)条件化培养基对体外培养兔角膜内皮细胞膜表面Na+-K+-ATP酶的分布及其酶活性的影响.方法 超微量ATP酶试剂盒测定原代培养兔角膜内皮细胞细胞膜表面Na+-K+-ATP酶的活性,并对ConA条件化培养基作用下不同生长周期(5、7、10 d)细胞Na+-K+-ATP酶的活性进行测定;免疫酶组织化学电镜下观察不同培养基作用下体外培养角膜内皮细胞膜表面Na+-K+-ATP酶的分布.结果 ConA条件化培养基组兔角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶活性明显高于无ConA组(P＜0.01),原代细胞生长7～10 d时Na+-K+-ATP酶活性高(P＜0.01).单层兔角膜内皮细胞膜外侧可见Na+-K+-ATP酶阳性反应.在ConA条件化培养基处理组,其阳性反应物较多、致密;而在无ConA组则阳性反应物较少、疏松.结论 体外原代培养角膜内皮细胞在7～10 d时,Na+-K+-ATP酶活性高.ConA条件化培养基可提高兔角膜内皮细胞Na+-K+-ATP酶活性.
关键词： 角膜内皮细胞 细胞培养 刀豆蛋白A Na+-K+-ATP酶 -
清热祛湿益气方对刀豆蛋白A诱导小鼠急性肝损伤的保护作用
含量升高,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:QSYF对Con A诱导的急性肝损伤小鼠具有保护作用.
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复肝方对肝纤维化小鼠肝功能的影响
目的:探讨复肝丸防治肝纤维化的作用机理.方法:采用刀豆蛋白A诱导免疫损伤性肝纤维化小鼠为实验对象,分正常组(10只)、模型组(15只)、复肝丸组(15只),秋水仙碱阳性对照组(15只).对各组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、直接胆红素(DBIL)生化指标进行统计分析.结果:复肝丸与模型组比较,ALT、DBIL显著降低、ALB明显提高,差异均有显著性意义(P＜0.05),AST有所改善,无显著性差异.结论:复肝方能够切中肝纤维化的重要病理环节,具有良好的抗肝纤维化作用.
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扶正祛邪方对Con A诱导肝损伤模型小鼠的影响
目的:研究扶正祛邪方对Con A诱导肝损伤模型小鼠的影响.方法:各药物组连续7 d以相应的药物进行预处理.除空白组外各组末次给药后1 h,小鼠尾静脉注射ConA,20 mg/kg,6 h后眼眦静脉取血,分离血清,测定ALT、AST、TBIL,取组织计算肝、脾指数.结果:扶正祛邪方可显著降低模型小鼠外周血ALT、AST 、TBIL水平及肝、脾指数.结论:扶正祛邪方可明显改善Con A诱导肝损伤模型小鼠的肝功能.
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双歧杆菌脂磷壁酸对刀豆蛋白A活化小鼠肝细胞肿瘤坏死因子-α和一氧化氮水平的影响
目的 研究双歧杆菌脂磷壁酸(LTA)对刀豆蛋白A(Con A)活化小鼠肝细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)水平的影响,探讨临床应用LTA治疗免疫性肝损伤的可能性.方法 将用胶原酶灌注法获取的小鼠肝细胞分为对照组(达尔伯克改良伊格尔培养基完全培养液)、LTA+ Con A处理组(LTA终浓度分别为1.0、2.0、4.0 μg·L-1,Con A终浓度为10 mg·L-1)和Con A组(Con A终浓度为10 mg·L-1)；细胞处理24 h后,采用酶联免疫吸附法测定肝细胞上清液中TNF-α和NO水平,反转录-聚合酶链反应检测肝细胞TNF-α mRNA水平.结果 Con A组肝细胞上清液中TNF-α和NO水平及肝细胞TNF-α mRNA水平均显著高于对照组(P＜0.05),不同浓度的LTA处理后上述各指标均较Con A组显著降低(P＜0.05),且LTA的作用与其浓度呈一定的梯度关系.结论 LTA可能通过抑制Con A活化的小鼠肝细胞体外TNF-α和NO的生成发挥对免疫性肝损伤的保护作用.
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山豆根非生物碱部位对免疫性肝损伤模型小鼠的影响
目的 研究山豆根非生物碱部位对免疫性肝损伤小鼠的保护作用.方法 90只小鼠随机分成9组,设正常对照组、模型组、甘利欣(40 mg·kg-1,ig)对照组和山豆根总成分、非生物碱成分分别以100,200和400 mg·kg-13个剂量组ig,每组10只.给药7d,分别于第7天灌胃后30 min尾静脉注射Con A 25 mg/kg以造成免疫肝损伤模型.于造模后第8小时摘眼球取血,称量肝脾,记录肝脾指数,检测血清ALT、AST以及肝组织匀浆中MDA、NO、SOD和GSH含量,HE染色切片观察肝组织病理学变化.结果 山豆根非生物碱成分能够明显降低免疫性肝损伤小鼠的肝脾指数(P＜0.05)；降低血清中ALT、AST含量(P＜0.05)以及肝组织匀浆中MDA、NO含量(P＜0.05)；提高SOD、GSH含量(P＜0.05)；肝脏病理改变显著减轻(P＜0.01).结论 山豆根非生物碱成分对免疫性肝损伤具有显著的保护作用,与山豆根总成分相近,稳定肝细胞膜正常结构,加强组织修复,清除自由基,抑制脂质过氧化可能是其作用机制之一.
