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模式动物斑马鱼在环境毒理学中的实验方法和检测指标
斑马鱼由于具备便于获得、生长快速、实验费用小且与人类基因相似度较高等特点,近年来斑马鱼被广泛应用于人类疾病模型及药物筛选、毒理学与环境检测中,使其成为新型的脊椎模式生物.本文从模式动物在环境毒理学中的应用角度,论述了斑马鱼在环境毒理学研究中的实验方法和相关的检测指标,旨在为初涉斑马鱼研究工作的实验室和研究人员提供早期的工作借鉴,使斑马鱼的研究更好的应用于环境毒理学中.
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氯化两面针碱对斑马鱼胚胎毒性的研究
目的 采用斑马鱼胚胎发育技术方法研究氯化两面针碱(Nitidine Chloride,NC)对斑马鱼胚胎的毒性效应.方法 将4 hpf发育正常的胚胎分别置于一系列含有不同浓度NC的胚胎培养液中进行培养,测定不同发育时间点斑马鱼胚胎发育的畸形率、死亡率、LD50和ED50.结果 随着药物浓度的增加,斑马鱼胚胎的死亡率、畸形率增加；随胚胎在含有药物的培养液中培养时间的增加,死亡率、畸形率增加.结论 NC的浓度与斑马鱼胚胎发育毒性存在明显的剂量-效应关系；NC作用时间长短与斑马鱼胚胎发育毒性亦存在明显的相关效应.
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丙烯酰胺对斑马鱼胚胎发育过程中microRNA表达的影响
目的 研究丙烯酰胺(ACR)对斑马鱼胚胎发育过程中小分子RNA(miRNA microRNA)表达的影响,探讨丙烯酰胺发育毒性机制.方法 将斑马鱼胚胎分为10mmol/LACR染毒组,二甲亚砜(DMSO)组和空白对照组,分别处理受精后6 h的斑马鱼胚胎(6 hpf hours past fertilization);采用核苷酸锁定(LNA locked nucleic acid)修饰的microRNA探针进行胚胎整体原位杂交.结果 10 mmol/LACR可导致斑马鱼胚胎表现出多系统的畸形,胚胎表现出心率减慢,心包水肿,体轴缩短;胚胎整体原位杂交显示ACR诱导miRNA表达增加.结论 ACR对斑马鱼胚胎发育过程中microRNA的表达有影响.
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PCB126暴露对斑马鱼胚胎发育及氧化应激的影响
目的 探讨类二噁英多氯联苯PCB126通过氧化应激损伤介导的胚胎发育毒性机制.方法 用不同浓度的PCB126(0、16、32、64和128 μg/L)对斑马鱼胚胎进行水触媒染毒,检测PCB126对不同发育阶段斑马鱼胚胎存活率、心包卵黄囊水肿率、心率及铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量的影响.结果 从144 hpf后,随着PCB126浓度的增加,斑马鱼胚胎存活率明显下降(P＜0.05),168 hpf时,128 μg/L浓度组斑马鱼胚胎全部死亡;从96起,斑马鱼幼鱼心包卵黄囊水肿率显著增加(P＜0.01),到144 hpf时,32 μg/L浓度组水肿率达100％;在96和132 hpf时,128μg/L浓度组斑马鱼胚胎心率显著降低(P＜0.01).24 hpf时,各染毒组斑马鱼胚胎CuZn-SOD、CAT活性无明显变化,但64 μg/L组MDA含量增加;72 hpf时,各染毒组CuZn-SOD活性降低,其中16和128μg/L组差异有统计学意义(P＜0.01),64和128 μg/L组CAT酶活性降低(P＜0.05),32和128 μg/L组MDA含量增加(P＜0.05);96 hpf时,各染毒组斑马鱼CuZn-SOD及CAT活性均显著降低(P＜0.01),32和128 μg/L组MDA含量增加;132 hpf时,各染毒组斑马鱼胚胎CuZn-SOD和CAT活性均降低,MDA含量显著增加(P＜0.01).结论 一定剂量的PCB126对斑马鱼胚胎发育具有致畸、致死作用,而氧化应激是其引起胚胎致畸、致死的重要机制之一.
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氯化两面针碱对斑马鱼胚胎SOD和MDA的影响
目的 研究不同浓度的氯化两面针碱对斑马鱼胚胎中的SOD活性及MDA含量的影响.方法 用正常发育后6 h(6 hpf)的胚胎进行不同浓度(0.5、1、2和3 mg/L)的氯化两面针碱药物处理72 h.药物处理完毕后,测定胚胎72 h的SOD活力及MDA含量.结果 SOD在0.5 mg/L组中活力明显高于对照组(P＜0.01)；随着药物浓度的增加,SOD活力与对照组相比,明显下降(P＜0.01).MDA含量在1、2和3 mg/L实验组中,随着药物浓度的增加而显著增加；0.5 mg/L组中,MDA含量与对照组接近.结论 不同浓度的氯化两方针碱对斑马鱼机体中的SOD活力及MDA含量产生不同的影响,从而对胚胎产生保护或损伤作用.
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长春新碱对斑马鱼神经发育和行为的影响
目的 以斑马鱼胚胎/幼鱼为实验对象,探索长春新碱对斑马鱼神经发育毒性和行为的影响及其毒性的分子机制.方法 采用表型观察、触及逃避、幼鱼的自主运动、强光刺激惊恐反射能力等实验及RT-PCR,整体免疫荧光等手段.结果 (1)长春新碱具有斑马鱼胚胎神经和心脏发育毒性;(2)长春新碱具有幼体神经毒性,幼鱼呈浓度依赖性的侧卧体位;自主运动显示幼鱼呈长春新碱浓度依赖性的常规转弯能力下降,运动轨迹紊乱,平均运动速度降低,不活跃运动持续时间增加等神经抑制行为;(3)光刺激实验显示高剂量(30和40 μg/ml)长春新碱处理组幼鱼被刺激后应激反应能力变弱,学习记忆能力下降;(4)长春新碱导致多巴胺能神经元相关基因th、dat的转录水平下调,诱导幼鱼间脑及下丘脑多巴胺神经元细胞数量减少.结论 长春新碱具有多巴胺能神经元毒性,导致下丘脑多巴胺能神经元细胞丢失.
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斑马鱼模型在药物毒性与安全性评价中的应用
目前国际上公认的药物毒性与安全性评估实验方法分为体外与体内实验2种.体外实验具有快速、高效和经济等优点,但体外实验通常不涉及药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄,因此筛选结果与整体动物试验结果可比性差.体内实验能提供可比性较高的筛选评估结果,但实验周期较长、成本高,不适用于高通量筛选等因素又限制了该方法在药物毒性筛选领域的应用.斑马鱼模型用于新药筛选始于20世纪90年代,由于其快速、经济、预测性好、可比度高的特点,目前斑马鱼模式动物已被越来越多的药物研发机构应用于药物毒性与安全性评价中[1-5].
关键词： 斑马鱼 药物毒性与安全性评价 体内分析 -
斑马鱼对化合物影响学习认知与记忆的探索分析
1 前言随着科学技术的发展,新化学物质日益增多.目前部分化合物的毒性已被阐明,而大部分化学物质对健康的潜在影响尚未完全清楚,所以对外源化合物的危险度评价显得尤为重要与紧迫.传统毒理学实验常用啮齿类动物作为实验对象,但是其花费大,实验周期长,难以对大量物质进行高通量试验.随着3R(reduction,replacement and refinement)原则的实施,整体动物实验面临着严峻的挑战[1].替代毒理学的发展,相关的非哺乳类动物替代模型已被证实可以用于毒理学的研究中,如黑头呆鱼、非洲爪蟾、虹鳟鱼及斑马鱼等[2].其中,斑马鱼更是凭借着体型小,繁殖能力强,发育同步,胚胎透明及基因与哺乳动物具有高度保守性的特点,成为研究化学物质神经行为毒性的理想生物模型之一[3].
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斑马鱼在生态毒理学中的应用进展
斑马鱼(Zebrafish,Danio rerio)属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio),是一种小型的热带淡水硬骨鱼类,原产于印度、孟加拉国等南亚国家,成鱼体长3～5 cm,身上有斑马样条纹,故得名斑马鱼[1-2].斑马鱼适宜在25 ～ 31℃之间生长和繁殖,对水质要求不高,以中性或弱碱性水为宜.斑马鱼孵化后3个月即可达到性成熟,但一般会在5个月后进行繁殖.雌性斑马鱼一次可产200 ～400颗卵,繁殖周期为1～2周,温度适宜时,一年四季均可产卵.受精卵在24 h即可发育成型,48～72 h内即可孵化成幼鱼.斑马鱼作为继人和小鼠之后的第三大模式生物,被越来越广泛地应用于毒理学研究.本文对斑马鱼在生态毒理学研究中的应用情况进行综述并加以展望.
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斑马鱼在农药生态风险评估中的应用
农药的环境污染及危害已经引起国际上许多国家的重视,滥用农药、兽药是导致农畜产品中有毒有害物质残留量高的重要原因.目前已有很多国家规定,农药、医药、食品添加剂、工业化学品和化妆品等的登记需进行环境风险评估,而对水生生物的风险评估是其中一项重要内容.在我国的农药登记资料规定中,对鱼的急性毒性试验数据是开展农药环境风险评估的重要端点数据.在农药生态风险评估中,斑马鱼(zebrafish,Danio rerio)是开展农药对鱼类急性毒性和慢性毒性试验的重要生物试验材料,本文就斑马鱼在农药生态风险评估中的应用及进展作总结,为未来研究提供参考依据.
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邻苯二甲酸二丁酯对斑马鱼胚胎发育毒性的研究
目的 对成年斑马鱼进行邻苯二甲酸二丁酯(DBP)急性染毒,观察其胚胎发育过程,探索DBP对其胚胎发育的影响.方法 选取健康成年斑马鱼80条,雌雄各半,适应性分开饲养1个月后,分别分成4组,给予1250μg/L和625μg/L DBP经水染毒,同时设溶剂(0.01%丙酮)对照组和空白对照组.染毒7天后,按雌雄1:1的比例交配,在倒置显微镜下观察整个胚胎发育过程,并计算受精率、72h死亡率、仔鱼72h孵化率及出生体重和身长.结果 各组的2h受精率的大小如下:空白对照组丙酮对照组625μg/L DBP染毒组1250μg/L DBP染毒组,分别为98.09%、95.76%、95.31%和94.42%.而各组的72h死亡率分别为18.29%、23.34%、49.45%和72.41%.72h孵化率分别为96.43%、82.37%、48.11%和26.79%.染毒组的死亡率高于非染毒组,孵化率低于非染毒组.与正常组和丙酮时照组相比,1250μg/L和625μg/L DBP染毒组胚胎发育明显迟缓,仔鱼身长明显变短,并有统计学差异.暴露剂量越大,身长越短.结论 625μg/L以上剂量的DBP染毒能导致斑马鱼胚胎发育迟缓.
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邻苯二甲酸二丁酯对F1代雄性斑马鱼性腺发育影响的研究
目的 探讨邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对F1代雄性斑马鱼性腺发育的影响.方法 将48对成年斑马鱼随机分为4组:空白对照组、丙酮溶剂对照组、125μg/L DBP高剂量组和625μg/L DBP低荆量组.每组12对、设两个鱼缸.连续暴露于DBP 30天后,将各组的雌雄鱼交配,孵化出的F1代斑马鱼在清水中饲养至180dph.各组随机选择20条F1代雄性斑马鱼,行性腺指数(GSI)分析以及精巢组织病理学检查.结果 与对照组相比,DBP高剂量组F1代雄鱼的GSI值为5.23%±1.5%,明显低于空白对照组(6.09%±2.5%)或溶剂对照组(6.08%±1.2%)(P<0.05).精巢组织学检查表明,成年斑马鱼DBP暴露明显抑制F1代雄鱼的性腺发育.引起生精小管畸形,且精巢间质(Leydig)细胞广泛而明显的增生与精子数量减少同时存在的特征十分明确.结论 出生前暴露于DBP可使F1代斑马鱼成年后的精巢发育受到不同程度的抑制,生精小管畸形,精子数量减少及Leydig细胞大量增生同时存在于精巢中.DBP在雄性斑马鱼体内的这种抗雌激素活性与它引发雄性大鼠、狨猴和人类的睾丸反应相类似.
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连接蛋白Cx50 S258F突变体对斑马鱼晶状体发育的影响
目的:研究与先天性白内障相关的连接蛋白Cx50 S258F突变体对斑马鱼晶状体发育的影响.方法:将野生型和携带S258F突变的Cx50编码区分别构建到pcDNA3.1 myc/his真核表达载体上,通过体外转录获得相应的RNA产物,将RNA产物分别显微注射到1细胞期的斑马鱼胚胎,通过显微镜观察斑马鱼晶状体表型,并利用全胚原位杂交技术分析过表达野生型和突变型Cx50对晶状体标志基因Cx23表达的影响.结果:与野生型胚胎相比,S258F突变型Cx50过表达引起斑马鱼胚胎白内障表型,过表达野生型Cx50也引起白内障表型,但是畸形数量明显少于突变型,野生型和突变型Cx50的过表达均下调了Cx23的表达.结论:连接蛋白Cx50 S258F突变体可引起斑马鱼白内障表型,提示Cx50的S258F突变体是造成先天性白内障的原因.
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叶酸对阿霉素诱导心脏毒性的拮抗作用研究
目的:探究叶酸对阿霉素(DOX)诱导心脏毒性的拮抗作用.方法:利用DOX(40μmol/L)与叶酸(75μmol/L)处理6hpf斑马鱼胚胎,72hpf时观察胚胎心包水肿情况,计录胚胎15s内心率,荧光显微镜下观察心脏结构,固兰染色观察心脏血细胞分布和量.利用DOX(5μmol/L)与叶酸(75μmol/L)共处理心肌细胞,免疫印迹试验检测切割后的半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase3)的水平.结果:DOX处理后胚胎表现出心包水肿、心率降低、心脏结构异常.叶酸与DOX共处理后胚胎心包水肿率降低至17％,低于DOX单处理组(P=0.0097)(n=25);心率恢复至37±1.6次/15 s,高于DOX单处理组(P＜0.001)(n=10);叶酸抑制DOX引起的心脏结构异常,并且使固兰染色异常率降低至22.4％,低于DOX单处理组(P=o.0098)(n=35).叶酸抑制DOX诱导的心肌细胞切割后的Caspase3水平升高.结论:叶酸对DOX诱导的心脏毒性具有一定的拮抗作用,其作用机制可能与抑制心肌细胞凋亡相关.
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香加皮对斑马鱼发育毒性及心脏毒性的影响
目的 探讨香加皮水提液对斑马鱼的发育毒性及不同暴露时间药物对心脏毒性的影响.方法 参照经济合作与发展组织推荐的方法,将受精后6小时(6 hour-post-fertilization,6 hpf)胚胎暴露在含有不同浓度香加皮水溶液的24孔板中,分别在24、48、72、96 hpf阶段测定胚胎/幼鱼的自主抽动次数、心率、孵化率、死亡率等指标.随后,使用不同浓度的香加皮水溶液处理发育至48、72、96 hpf的斑马鱼24小时,通过死亡率确定不同暴露阶段对斑马鱼心脏毒性的影响.结果 各暴露组24 hpf自主抽动次数增加、48 hpf心率以及72 hpf孵化率显著降低,与正常对照组相比均有显著性差异(P<0.05);24 hpf低浓度给药组胚胎发育迟缓、眼点未发育、头部偏小或未发育,高浓度组发育畸形或停留在体节期;48 hpf胚胎卵黄囊畸形、黑色素生成抑制、尾芽未脱落;72 hpf 幼鱼出现身体弯曲、心包水肿、卵黄囊畸形等中毒症状.不同发育阶段斑马鱼急性毒性暴露实验结果表明:香加皮对48、72、96 hpf斑马鱼的半数致死浓度(LC50)分别为:0.866 mg/mL、0.693 mg/mL和0.843 mg/mL.结论 香加皮对斑马鱼具有明显的发育毒性和心脏毒性,且48 hpf斑马鱼非常适合进行心脏毒性药物筛选.
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基于斑马鱼模型筛选壮骨关节丸毒性药味高效筛选
目的:采用斑马鱼模型高效筛选壮骨关节丸中有毒性的药味.方法:将受精后1天(1 day post fertilization,1dpf)的斑马鱼胚胎暴露于壮骨关节丸及方中1 2种药味不同浓度水煎液和醇提液中,观察记录给药后2-6 dpf或2-8 dpf的死亡数量,于3 dpf显微检视斑马鱼幼鱼状态,SPSS软件计算6 dpf的斑马鱼半数致死浓度LC50.结果:斑马鱼暴露于壮骨关节丸及补骨脂、续断、乳香没药、独活和木香的水、醇提取液,以及鸡血藤和狗脊的醇提液毒性较大,致鱼卵黄囊肿大、变形或变黑,提示与肝毒相关,6 dpf鱼的LC50为33.2-392.7 μg·mL-1(已折算为生药量,下同);淫羊藿水、醇提取液均在1 500 μg·mL-1致鱼卵黄囊肿大、变黑,LC50为1 100-1 350 μg·mL-1,有一定毒性;鸡血藤和狗脊的水煎液,以及骨碎补、桑寄生和熟地黄的水、醇提取液未致鱼脏器明显改变,LC50大于1 500 μg·mL-1,故安全性较好.结论:斑马鱼模型高效辨识了壮骨关节丸不同药味毒性差异,可实现复杂中药中潜在毒性物质的在体、实时、动态、规模化的高效筛选.
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南蛇藤提取物对人肝癌细胞HepG2上皮间质转化的影响＊
目的：结合体内外实验研究南蛇藤提取物对人肝癌细胞HepG2上皮间质转化的作用及分子机制。方法：取对数生长期HepG2细胞，除对照组外，分别给予南蛇藤提取物10、20、40、80、160滋g·mL-1培养，采用Western Blotting法检测上皮间质转化（EMT）相关蛋白的表达水平；斑马鱼胚胎，于受精后48 h开始给药，正常组给予E3缓冲液，DMSO组为含1% DMSO的E3缓冲液，南蛇藤组各药物浓度分别为10、20、40、80、160滋g·mL-1；给药24 h后，以Western Blotting法检测mTOR信号通路相关蛋白的表达水平。结果：与对照组相比，南蛇藤提取物各浓度组明显增加E-cadherin的表达量，降低vimentin和mTOR信号通路相关蛋白的表达水平。结论：南蛇藤提取物能在一定程度上逆转人肝癌细胞EMT ，其分子机制可能与mTOR信号通路相关，mTOR可作为临床治疗肝癌的新靶点。
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接骨汤抗泼尼松龙诱导斑马鱼骨丢失的作用研究
目的：本文采用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型，研究临床优效方接骨汤防止骨丢失，促进骨生成的作用。方法：将受精后5天的斑马鱼幼鱼暴露在含25μmol·L-1泼尼松龙的不同浓度接骨汤（0.025、0.25、2.5、25、100 mg生药·L-1）溶液中，同时设25μmol·L-1泼尼松龙模型药物组，含25μmol·L-1泼尼松龙的依替膦酸二钠（15、30 mg·L-1）阳性药物组及0.5% DMSO溶媒对照组。28.5oC下在24孔板中培养，每天换液培养至第10天处死。采用茜素红对培养10天的各组斑马鱼幼鱼骨骼染色，并以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域。结果：与溶媒阴性对照组相比，25μmol·L-1浓度泼尼松龙组（模型组）的斑马鱼骨骼染色面积和染色光密度值显著减少；与模型组比，依替膦酸二钠（15、30 mg·L-1）和接骨汤（2.5、25、100 mg生药·L-1）组的鱼骨染色矿化面积和累积光密度值显著增加，且呈一定量效关系。结论：用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型成功评价了接骨汤防止骨丢失，促进骨生成的作用，为该模型的合理性与可靠性提供依据。
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基于模式生物斑马鱼创立中药壮骨效应评价新模型的思路与方法
中药治疗骨质疏松的功效正日益受到重视,但壮骨中药及其成分特别是量微成分的活性评价却难以高效开展.新模型、新方法的建立有益于丰富中药壮骨效应评价的思路与方法.模式生物斑马鱼是一种极好的、热门的药学研究工具,根据其骨骼发育的生理、遗传学特点和优势,将斑马鱼用于中药复杂体系及其成分的壮骨效应评价,具有合理性和可行性.本文概述了中药壮骨效应评价的现状及不足,分析了斑马鱼中药壮骨效应评价模型建立的依据,提出了斑马鱼中药壮骨效应评价模型的建立方法,并对该模型的前景进行展望.
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冬凌草甲素抑制血管生成活性及作用机制
目的:研究冬凌草甲素抑制血管生成的活性及其作用机制.方法:采用体外和体内两种模式,研究冬凌草甲素在血管生成方面的抑制效应.通过体外培养心脏微血管内皮细胞,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的活力,酶联免疫吸附(ELISA)法测定血管内皮生长因子(VEGF)的含量;体内选择斑马鱼(Fli1-GFP)生物模式,观察冬凌草甲素对胚胎期血管生成和成鱼期血管损伤后再生的影响,并采用相对荧光定量PCR法检测VEGF通路上主要相关基因VEGFA,血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)2,VEGFR3的表达量.结果:冬凌草甲素具有抑制血管生成活性的作用,可抑制体外内皮细胞活力,其半抑制浓度(IC50)8.04 mg·L-1,可使细胞血清中VEGF的表达量明显下降;可抑制斑马鱼胚胎期体节间血管生成,且抑制成鱼期血管损伤后再生,可能通过降低体内VEGFA,VEGFR2,VEGFR3基因的表达量从而抑制血管生成.结论:冬凌草甲素可有效抑制血管生成,为其抗肿瘤血管生成治疗提供了重要的科学依据.
