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益肺活血复方对人肺动脉内皮细胞分泌功能的影响
目的 研究益肺活血复方对人肺动脉内皮细胞分泌功能的影响.方法 建立人肺动脉内皮细胞低氧高二氧化碳模型；制备益肺活血复方不同给药剂量(生药10、20、40 g ·kg-1)的含药血清及生理氯化钠溶液血清；在细胞培养液中共同孵育12 h后,利用免疫组织化学法测定细胞内低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,放射免疫分析法测定各组细胞上清液中内皮素-1(ET-1)的浓度,逆转录多聚酶链反应法测定ET-1 mRNA的表达水平.结果 低氧高二氧化碳条件下,人肺动脉内皮细胞ET-1的分泌、HIF-1α蛋白和ET-1 mRNA的表达明显增强(P＜0.05)；而中、高浓度益肺活血复方能够抑制人肺动脉内皮细胞合成分泌HIF-1α、ET-1 mRNA及ET-1(P＜0.05).结论 低氧高二氧化碳导致人肺动脉内皮细胞功能障碍,而中、高浓度的益肺活血复方可减少人肺动脉内皮细胞ET-1的分泌和ET-1 mRNA、HIF-1 α蛋白的表达,从而减轻人肺动脉内皮细胞功能紊乱的程度,益肺活血复方可能成为治疗低氧高二氧化碳性肺动脉高压的有效药物.
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S1PR2和S1PR3通路激活Rac1参与HGF诱导的血管内皮屏障保护作用
目的 观察肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)介导的1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)和1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)通路是否通过激活Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)增加血管内皮屏障保护功能.方法 培养人肺动脉内皮细胞,应用小RNA干扰技术静默S1PR2/3后,给与HGF处理并应用GTP酶沉降及Western blot检测技术检测人肺血管内皮细胞GTP-Rac1活性变化.结果 静默S1PR2或S1PR3后,给与HGF处理,GTP-Rac1活性较S1PR2或S1PR3未静默组明显减弱.结论 HGF介导的S1PR2和S1PR3通路通过激活Rac1增加血管内皮屏障保护功能.
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细菌脂多糖诱导人肺动脉内皮细胞表达P-MLCK
目的 探讨细菌脂多糖(LPS)对人肺动脉内皮细胞(HPAEC)表达磷酸化肌球蛋白轻链激酶(phosphorylated myosin light chain kinase, P MLCK)的诱导作用.方法 体外培养HPAEC,分别给予生理盐水和2 μg/mL LPS孵育1 h,经免疫荧光显微镜和Western blotting检测P MLCK.结果 与生理盐水组比较,LPS刺激HPAEC后较生理盐水组细胞数量减少,细胞形态无明显改变.HPAEC在LPS刺激30、60 min后,P MLCK表达由0.41±0.05分别增加至0.82±0.43和1.56±0.07(P<0.05,P<0.01),同时LPS 30 min组和60 min组比较有显著性差异(P<0.05);LPS刺激60 min后P MLCK免疫反应细胞由1.25±2.1增加至16.4±4.8(P<0.01).结论 P MLCK可能与LPS诱导的急性肺损伤所致的内皮细胞屏障功能障碍有关.
关键词： 人肺动脉内皮细胞 细菌脂多糖 磷酸化肌球蛋白轻链激酶 -
埃他卡林通过c-JNK信号通路抑制缺氧诱导的人肺血管内皮细胞凋亡
目的:研究KATP通道开放剂埃他卡林在缺氧诱导的肺血管内皮细胞凋亡调节中的作用及机制.方法:细胞分组培养并经过药物及缺氧处理后,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法对细胞活性进行测定,同时采用Hoechst 33342染色法检测细胞凋亡,采用Western blot对JNK、磷酸化JNK、caspase-3等蛋白的表达进行检测.结果:缺氧可降低细胞活性,诱导肺动脉内皮细胞凋亡,而埃他卡林可抑制凋亡,这种细胞保护作用可被KATP拮抗剂5-HD阻断;埃他卡林可抑制缺氧引起的c-JNK通路的磷酸化激活,并抑制下游凋亡蛋白caspase-3的表达,与c-JNK抑制剂SP600125作用一致,而5-HD处理组的趋势则相反.结论:埃他卡林可通过开放KATP通道抑制缺氧诱导的肺动脉内皮细胞凋亡,这种保护机制涉及了对c-JNK通路及下游凋亡蛋白的调节.
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TNF-α诱导的人肺动脉内皮细胞GITRL的表达及意义
目的 研究糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关蛋白配体(GITRL)在TNF-α诱导的人肺动脉内皮细胞(HPAECs)中的表达及意义.方法 原代培养HPAECs,分别加入TNF-α0、5、10、20 ng/ml培养2、12、24、48、72 h后,采用RT-PCR和Western blot分别检测GITRL mRNA和蛋白表达,ELISA法检测GITRL在细胞上清液中的表达水平.结果 TNF-α呈浓度和时间依赖性地促进GITRLmRNA及其蛋白和上清液GITRL表达水平,其中TNF-a浓度为10 ng/ml、培养时间为72 h时的表达量高(P＜0.05或P＜0.01).结论 GITRL在TNF-α诱导的HPAECs中表达增加,提示GITR/GITRL可能参与HPAECs的损伤机制,在肺动脉高压的发病过程中起重要作用.
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瘦素-p38 MAPK通路在间歇低氧致肺动脉内皮损伤中的作用
目的 探讨瘦素-p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路在间歇低氧致肺动脉内皮损伤中的作用.方法 体外培养人肺动脉内皮细胞(HPAECs),采用随机数表法分为间歇低氧组及正常氧组,每组内部再随机分为0、40、80ug/mL瘦素预处理组,80ug/mL瘦素+瘦素受体拮抗剂BY0961预处理组以及80ug/mL瘦素+p38MAPK拮抗剂SB203580预处理组,分别采用RT-PCR及Western blot检测各组细胞p38MAPK mR-NA及蛋白表达变化,ELISA法测定培养上清中内皮素-1(ET-1)、内皮素转换酶(ECE)水平,硝酸酶还原法测定培养上清中一氧化氮(NO)浓度.结果 无论是在间歇低氧组还是正常氧组,40ug/mL瘦素预处理后,p38MAPK mRNA表达均较0ug/mL瘦素预处理组(间歇低氧组,0.42±0.08 vs 0.13±0.05,P<0.05;正常氧组,0.25±0.08 vs 0.06±0.05,P<0.05)显著升高,p38MAPK蛋白表达(间歇低氧组,0.52±0.07 vs 0.36±0.06,P<0.05;正常氧组,0.14±0.04 vs 0.02±0.01,P<0.05)显著升高,ET-1水平〔间歇低氧组,(23.65±5.24)pg/mL vs(15.24±4.76)pg/mL,P<0.05;正常氧组,(8.64±2.77)pg/mL vs(3.27±1.48)pg/mL,P<0.05〕显著升高,ECE水平〔间歇低氧组,(13.76±3.48)pg/mL vs(8.42±2.15)pg/mL,P<0.05;正常氧组,(6.25±1.93)pg/mL vs(2.47±1.13)pg/mL,P<0.05〕显著升高,NO水平〔间歇低氧组,(40.24±8.95)umol/L vs(67.38±11.26)umol/L,P<0.05;正常氧组,(116.78±26.44)umol/L vs(195.46±32.07)umol/L,P<0.05〕显著降低;上述效应随瘦素浓度增加进一步增强,且可被瘦素受体拮抗剂以及p38MAPK拮抗剂阻断.结论 瘦素通过激活p38MAPK通路加重血管内皮损伤.
关键词： 瘦素 p38丝裂原激活蛋白激酶 人肺动脉内皮细胞 -
埃他卡林对人肺动脉内皮细胞内皮素系统的作用
目的 研究新型ATP敏感性钾通道(K_(ATP))开放剂埃他卡林(iptakalim,IPT)对人肺动脉内皮细胞内皮素(ET)系统的作用.方法 原代培养人肺动脉内皮细胞(HPAECs),分别加入不同浓度埃他卡林,共同孵育24 h后;应用放射免疫法测定各组细胞上清内皮素-1(ET-1)浓度的变化,同时用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法 检测各组细胞ET-1及内皮素转换酶(ECE)mRNA表达的变化. 结果 在IPT浓度为10~(-6) mol·L~(-1)及以上时,能够剂量依赖性地抑制HPAECs合成分泌ET-1,同时也降低ET-1 mRNA的表达量;在IPT浓度为10~(-7) mol·L~(-1)及以上时,能够剂量依赖性地降低ECE mRNA的表达量.结论 IPT通过抑制人肺动脉内皮细胞ET-1和 ECE mRNA的表达量,继而抑制内皮细胞合成分泌ET-1,可能成为较有前途的治疗肺动脉高压的有效药物.
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内源性二氧化硫对氯化钴诱导人肺动脉内皮细胞凋亡的影响
目的 研究内源性二氧化硫(SO2)对氯化钴(CoCl2)诱导人肺动脉内皮细胞(HPAECs)凋亡的调节作用.方法 采用CoCl2诱导原代HPAECs制备低氧刺激细胞凋亡模型,采用慢病毒转染过表达内源性SO2生成关键酶天冬氨酸氨基转移酶1(AAT1),HPAECs分为4组:空载体(vehicle)组、vehicle+CoCl2组、AAT1组及AAT1+CoCl2组.采用Western blot法检测AAT1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)、Caspase-3蛋白和活化的Caspase-3(cleaved Caspase-3)的表达,采用比色法检测AAT活性,采用荧光探针原位检测HPAECs中SO2水平,采用依赖于末端脱氧核苷酸转移酶的 dUTP末端标记法(TUNEL)测定细胞凋亡.结果 4组HPAECs中SO2含量、AAT1和bcl-2蛋白表达及cleaved Caspase-3/Caspase-3比值差异均有统计学意义(F＝147.364、23.738、6.521、64.884,均P＜0.05),但bax蛋白表达差异无统计学意义(F＝1.620,P＞0. 05).与vehicle组相比,vehicle+CoCl2组HPAECs中AAT活性[(0.96 ± 0.24)Carmen's unit/μg比(2.21 ± 0.60)Carmen's unit/μg]、SO2水平(40.71 ± 7.72比105.60 ± 16.20)和bcl-2蛋白表达(0.59 ± 0.19比1.02 ± 0.20)均显著下降,细胞凋亡和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值(1.56 ± 0.25比0.95 ± 0.13)明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05);但AAT1蛋白表达差异无统计学意义(0.50 ± 0.12比0.53 ± 0.11,P＞0.05).与vehicle组相比,AAT1组HPAECs中SO2水平(351.50 ± 42.43比105.60 ± 16.20)和AAT1蛋白表达(1.22 ± 0. 33比0.53 ± 0.11)均显著升高,差异均有统计学意义(均 P ＜0.05).与 AAT1组相比,AAT1 +CoCl2组HPAECs中SO2水平(333.50 ± 46.22比351.50 ± 42.43)、AAT1蛋白表达(1.26 ± 0.36比1.22 ± 0.33)和bcl-2蛋白表达(1.14 ± 0.38比1.03 ± 0.27)差异无统计学意义,细胞凋亡和cleaved Caspase-3/Caspase-3比值(0.51 ± 0.17比0.50 ± 0.11)差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 内源性SO2可抑制CoCl2诱导HPAECs凋亡.
关键词： 二氧化硫 天冬氨酸氨基转移酶1 氯化钴 人肺动脉内皮细胞 凋亡 -
异甘草素对低氧环境下人肺动脉内皮细胞促炎性因子和HIF-1α表达的影响
目的 研究异甘草素对低氧诱导的人肺动脉内皮细胞分泌促炎性细胞因子和缺氧诱导因子1α表达的影响.方法 细胞分组:常氧组;低氧组;低氧+20μmol·L-1异甘草素组;低氧+40μmol·L-1异甘草素组;低氧+80μmol·L-1异甘草素组.酶联免疫吸附实验法检测各组细胞培养上清液中的肿瘤坏死因子-α和白介素-6的含量.实时荧光定量即时聚合酶链锁反应检测异甘草素对低氧诱导的人肺动脉内皮细胞缺氧诱导因子1αmRNA表达的影响.结果 低氧组肿瘤坏死因子-α和白介素-6的含量显著高于常氧组(P<0.05),3个低氧+异甘草素组肿瘤坏死因子-α和白介素-6的含量较低氧组显著降低(P<0.05);实时荧光定量即时聚合酶链锁反应结果显示,异甘草素有效抑制了低氧诱导的人肺动脉内皮细胞缺氧诱导因子1αmR-NA的高表达(P<0.05).结论 异甘草素能够有效抑制低氧诱导的人肺动脉内皮细胞促炎性细胞因子的分泌,以及抑制缺氧诱导因子1αmRNA的高表达.
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益肺活血复方对人肺动脉内皮细胞微结构及内分泌功能的影响
目的：观察益肺活血复方对人肺动脉内皮细胞微结构及内分泌功能的影响。方法：建立人肺动脉内皮细胞低氧高二氧化碳模型；制备益肺活血复方不同给药剂量（生药10、20、40 g/kg）的含药血清；在细胞培养液中共同孵育12 h后，利用透射电镜观察细胞微结构变化，采用放射免疫法测定各组细胞培养液上清中内皮素-1（ET-1）及前列环素（ PGI2）的含量，采用硝酸还原酶法测定细胞培养液中一氧化氮（ NO）的含量。结果：低氧高二氧化碳条件下，人肺动脉内皮细胞微结构损伤，而中、高剂量益肺活血复方组细胞微结构损伤减轻。各组细胞培养液或培养液上清中ET-1、NO、PGI2的含量比较，差异有统计学意义（F＝121．870、60．040、49．060，P均＜0．001）；模型组ET-1含量高于空白对照组，NO、PGI2含量低于空白对照组（P均＜0．01）；中、高剂量益肺活血复方组ET-1含量低于模型组，NO和PGI2含量高于模型组（P均＜0．01）。结论：低氧高二氧化碳导致人肺动脉内皮细胞微结构及功能障碍，而中、高剂量益肺活血复方可减轻其结构及功能损伤的程度。
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罗格列酮通过激活PPARγ改善肺动脉高压大鼠肺动脉内皮依赖性舒张功能
目的:探索过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮对肺动脉高压大鼠模型肺动脉血管内皮功能的影响.方法:(1)SD大鼠40只,分为正常对照组、模型组、罗格列酮组和罗格列酮+ GW9662(PPARγ拮抗剂)干预组,每组10只,以野百合碱(60 mg/kg)一次性皮下注射复制肺动脉高压大鼠模型,再灌胃给予罗格列酮(2.0 mg·kg-1·d-1)或罗格列酮+GW 9662 (0.3 mg·kg-1·d-1)干预.4周后,取血浆测一氧化氮(NO)及内皮素-1(ET-1)的水平,分离肺动脉二级分支,以微血管张力测定仪测定肺动脉血管功能变化情况.(2)体外培养人肺动脉内皮细胞株(HPAECs),探讨罗格列酮对HPAECs NO生成的影响.结果:罗格列酮可显著改善肺动脉高压大鼠血管内皮依赖性舒张功能,但不能显著改善非内皮依赖性舒张功能；罗格列酮干预可降低血浆ET-1水平,升高NO水平；但罗格列酮的以上作用在同时给予PPARγ拮抗剂GW9662时显著被减弱.体外实验证实,罗格列酮可显著增加HPAECs的NO生成,但该作用同样可被GW9662所阻断.结论:罗格列酮通过激活PPARγ改善肺动脉高压大鼠的血管内皮依赖性舒张功能可能是其治疗肺动脉高压的基础.
关键词： 罗格列酮 肺动脉高压 人肺动脉内皮细胞 一氧化氮 过氧化物酶体增殖物激活受体γ -
瘦素在间歇低氧致肺动脉内皮损伤中的作用
目的 探讨瘦素在间歇低氧致肺动脉内皮损伤中的作用.方法 体外培养人肺动脉内皮细胞(HPAECs),采用随机数表法分为间歇低氧组及正常氧组,每组内部再随机分为0μg/mL、40μg/mL、80μg/mL瘦素预处理以及80μg/mL瘦素+瘦素受体拮抗剂BY0961预处理组,Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白caspase-3表达,ELISA法检测细胞匀浆内皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平的变化,评估瘦素对HPAECs凋亡的影响.结果 无论是在间歇低氧组还是正常氧组,40μg/mL瘦素预处理后,caspase-3蛋白表达均均较预处理前显著增加[间歇低氧组:(0.53±0.06)vs(0.32±0.05);正常氧组:(0.13±0.03)vs(0.03±0.02)],eNOS水平显著降低[间歇低氧组:(0.57±0.11)ng/mL vs(1.34±0.18)ng/mL;正常氧组:(2.35±0.46)ng/mL vs(5.25±0.73)ng/mL],差异均有统计学意义(P<0.05);且随瘦素浓度增加该作用进一步增强,上述效应可被瘦素受体拮抗剂阻断.结论 瘦素加剧了间歇低氧条件下肺动脉内皮损伤,从而产生一系列并发症.
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ROS/ALOX5/NLRP3信号通路激活在低氧所致肺动脉内皮增殖中的作用
目的 考察ROS/ALOX5/NLRP3信号通路相关蛋白激活在低氧所致肺动脉内皮细胞增殖中的作用.方法 将人肺动脉内皮细胞分别在常氧状态(21％O2)和低氧状态(1％O2)下培养24、48、72及96小时,同时低氧状态下分别设立活性氧(ROS)清除剂Trolox组和ALOX5抑制剂齐留通组.采用CCK-8法检测细胞增殖率的改变,活性氧探针H2-DCFA检测低氧状态下肺动脉内皮细胞内ROS的变化,Western blot法分别检测低氧状态及加入Trolox或齐留通干预后ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白表达的变化.结果 肺动脉内皮细胞在低氧作用48、72及96 h后可见增殖显著,分别达(135.6±29.4)％、(185.3±21.7)％及(212.3±39.0)％.同时,细胞内ROS在24、48及72 h可检测到显著增加,96小时后基本恢复正常.ALOX5、NLRP3和Caspase-1蛋白随低氧时间增加而表达增多.预先加入ROS清除剂Trolox和ALOX5抑制剂齐留通均可抑制NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3和Caspase-1的表达,且细胞增殖率也显著降低.结论 ROS/ALOX5/NLRP3信号通路在低氧所致的肺动脉内皮细胞增殖中显著激活,抑制这一通路可显著减少低氧所致的内皮细胞增殖.
