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新型甘露聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达
构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1 530 bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56 438.此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanase A氨基酸序列同源性分别为64.3％、38％.将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化3株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这3种毕赤酵母中均实现分泌表达.将此3种重组毕赤酵母GS115 (pHBM730)、KM71( pHBM730)、SMD1168( pHBM730)诱导产酶,对这3种重组酶进行相关的酶学性质研究.分析表明,在KM71中表达量高,其适反应pH值均约为6.6,适反应温度均约为45℃.在适反应条件下测得其酶活力为19.64 U.此结果为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考.
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一种蚯蚓脱氧核糖核酸酶分离纯化和性质研究
蚯蚓组织的NaAc抽提液经过热变性、酸变性和丙酮分段沉淀,再经过DEAE-Sepharose和CM-Sepharose层析纯化,从中分离纯化得到一种脱氧核糖核酸酶(EWD2),经SDS-PAGE电泳、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、毛细管等点聚焦电泳法测定.此DNase的相对分子质量测定为69 100,明显大于已发现的DNase Ⅰ和DNaseⅡ.该酶的等电点为6.05,温度稳定性、pH稳定性、激动剂和抑制剂等各项参数,与已发现的各种DNase相比较有明显差别.结果提示,蚯蚓组织中发现的这种脱氧核糖核酸酶具有特殊的酶学性质,可能是一种新型脱氧核糖核酸酶,其作用机理和分类还有待于进一步的研究.
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黑曲霉SL2-111聚半乳糖醛酸酶的纯化和特性
通过硫酸铵分级沉淀、Sephcryl S-200分子筛柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析3个步骤,从黑曲霉SL2-111发酵的果胶酶粗品中纯化出一种电泳纯的聚半乳糖醛酸酶.经SDS-PAGE测定其相对分子质量约为71.5 ku.适pH值和适温度分别为3.0和65℃.在50℃以下,pH值2.6～5.4之间酶活力相对稳定.浓度为5 mmol/L的Ca2+、Li+、Cu2+、Mg2+、K+对酶活力有激活作用;而Mn2+和Ag+具有抑制作用.
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牛肝β-D-葡萄糖醛酸苷酶的分离纯化和性质研究
采用自溶、35%硫酸铵分部沉淀、CM-纤维素柱层析、羟基磷灰石柱层析由动物肝脏中分离纯化β-D-葡萄糖醛酸苷酶,获得比活26700U/mg的纯酶,活力回收率为42.8%,纯化的酶经SDS-PAGE呈单一条带.该酶以β-D-酚酞葡萄糖醛酸苷为底物的Km值为2.0×10-4mol/L,以对硝基苯酚葡萄糖醛酸苷为底物的Km值为2.5×10-4mol/L.在pH值5～6的范围内,该酶的活力较高,适pH值为5.5,在pH值5.5时稳定性好.在30～50℃范围内酶活力均较稳定.
关键词： β-D-葡萄糖醛酸苷酶 牛肝 纯化 酶学性质 -
葡萄糖-6-磷酸异构酶研究进展
葡萄糖-6-磷酸异构酶(Glucose phosphate isomerase,GPI)是一类多功能蛋白质,在糖代谢的糖酵解中催化葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之间的可逆反应,同时它还具有其他重要生理生化功能.人体GPI的缺乏可导致非球型血红细胞贫血症以及神经功能的紊乱,GPI还具有细胞因子的活性,并与类风湿关节炎的发生有密切关系.此外在渔业研究方面有研究表明,鱼体GPI具有特异抑制鱼体自身肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶活性的功能等.文章GPI的功能、空间结构、酶学性质及克隆表达等方面简要介绍了目前研究的一些情况.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸异构酶 蛋白质结构 酶学性质 克隆表达 综述 -
人参毛状根糖基转移酶的分离纯化及酶学性质研究
首次从人参毛状根中提取分离了糖基转移酶,用SDS-PAGE测定其相对分子质量为56.6 k.该酶以对羟基苯甲酸为底物时的Km=0.399 nmol/L,Vmax=2.74 nmol/min,反应的适温度为45℃,适pH值为8.0.该酶在60℃以下,pH 4.0～10.0范围内保持稳定.Na+,K+,Mg2+,Ca2+,Zn2+,Ag+,Ba2+对酶活力有抑制作用,Fe2+和Cu2+对酶活力有一定的促进作用,而Mn2+和Co2+对酶活力没有影响.
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蚯蚓纤溶酶的分离纯化及其部分酶学性质的研究
以野生环毛蚓(Pheretima)为材料,经匀浆抽提、热变性、硫酸铵分步沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤和DEAE-纤维素离子交换柱层析等纯化步骤,得到纯度较高的蚯蚓纤溶酶(EFE),具有强烈的溶解血纤维蛋白的作用.同时对酪蛋白和BAEE也具有较强的水解作用,但对ATEE无水解活性.实验表明蚯蚓纤溶酶能被苯甲磺酰氟强烈抑制,说明该酶是丝氨酸蛋白酶、属胰蛋白酶类.金属离子Na+、K+、Mg2+对此酶有一定的抑制作用,Hg2+对EFE有强烈抑制作用,而Ca2+可提高此酶活力.
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蚓激酶的提取纯化及性质研究
目的 建立高效的蚓激酶纯化工艺,并研究其酶学性质.方法 以赤子爱胜蚓(Eisenia foelide)为原料,经过匀浆抽提、硫酸铵分段盐析、色谱分离、电泳等技术对蚓激酶进行分离纯化及鉴定,并研究pH、温度、金属离子与抑制剂对蚓激酶活性的影响以及蚓激酶的作用机理.结果 纯化蚓激酶比活达5 100 U/mg,经SDS-PAGE电泳分析得2条带,相对分子质量为32000和33 500;体外溶栓实验表明,蚓激酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用.在中性和略偏碱性环境中稳定且活性高;温度适应范围广;不同种类及浓度的金属离子对蚓激酶活性的影响不尽相同;抑制因子及底物特异性研究发现,蚓激酶属于丝氨酸蛋白酶,不属于金属蛋白酶,同时含有二硫键.结论 该分离方法 可以得到较纯的蚓激酶.
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纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究
目的 研究纳豆激酶分离纯化工艺及酶学性质.方法 纳豆激酶发酵液的粗提物经Superdex 75凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离纯化,采用TAME法测定酶的活性,通过SDS-PAGE对纯化结果进行了检验.结果 SDS-PAGE中显示单一色带,相对分子质量28 000,以TAME为底物时纳豆激酶的米氏常数(Km)为35.47 mmol/L,适宜的温度37 ℃,适宜pH为8.6.结论 该分离纯化方法可以得到较纯的纳豆激酶.
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一种新型蚯蚓脱氧核糖核酸酶酶学性质的研究
目的 研究蚯蚓组织中1种新型脱氧核糖核酸酶(EWD1)的主要酶学性质.方法 用S DS-PAGE凝胶电泳、质谱分析、毛细管等点聚焦电泳法和酶活性测定等方法.结果 EWD1的相对分子质量约为157 000.Mn2+、Ca2+是该酶的抑制剂,Mg2+对酶的活性基本上没有影响.该酶的适温度为37℃,适pH值为 5.2,等电点为6.12.以小牛胸腺DNA为底物,测得Km为1.58 mg/mL,Vmax为5.36 mg/(m L·min).结论 蚯蚓组织中发现的此种脱氧核糖核酸酶EWD 1具有特殊的酶学性质,明显区别于已知的脱氧核糖核酸酶类.
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玉米SOD的分离纯化与部分性质研究
目的 建立1种高效而简单的玉米SOD分离纯化方法.方法 采用初步提取、40%～80%硫酸铵分级沉淀、Cu2+螯合亲和色谱和DEAE-纤维素离子交换色谱处理的方法从玉米中提取SOD.结果 获得了比活为1.18×104U/mg的SOD-A组分,活力回收率为11.7%;纯化后的SOD-A组分经PAGE和SDS-PAGE均为一条带;等电聚焦结果表明该组分的等电点为7.2;经鉴定,该组分属于Cu/Zn-SOD.稳定性研究表明,该组分对热、酸碱及常见变性剂(如尿素)的稳定性较好.结论 利用Cu2+螯合亲和色谱和DEAE-纤维素离子交换色谱相结合的方法可以纯化得到高比活、稳定性好的玉米SOD-A组分.
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高纯度木瓜蛋白酶的分离纯化和性质研究
目的 建立木瓜蛋白酶的分离纯化工艺路径.方法 采用初步采集处理,20%,40%硫酸铵分级沉淀、SP-sephadex C50柱色谱、羟基磷灰石柱色谱,从番木瓜乳汁中分离纯化木瓜蛋白酶.结果 获得比活为1 184 U/mg的纯酶,活力回收率为55.79%,纯化的酶经SDS-PAGE呈单一条带,高效液相色谱呈单一条带,纯度达到99.31%.该酶耐高温,适pH值为7.2,对酪蛋白的动力学常数(Km)为3.5×10-5 mol/L.结论 应用此方法成功纯化了高纯度的木瓜蛋白酶.
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拟南芥醇腈酶基因在大肠杆菌中的表达优化及酶学性质分析
[目的]优化重组醇腈酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达工艺,考察其酶学性质.[方法]基于密码子的偏好性,对拟南芥(Arabidopsis thaliana)醇腈酶基因进行密码子优化,克隆该基因到表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-HNL-At.采用单因素法优化表达工艺,Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,紫外荧光光度法考察酶学性质.[结果]通过IPTG诱导成功实现来源于拟南芥醇腈酶基因在大肠杆菌中的重组表达,对诱导条件优化后,发酵液中重组酶活力达到29.3U·mL-1,较未优化前提高68%.通过Ni柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,经SDS-PAGE分析重组醇腈酶相对分子质量约为30kDa.通过酶学性质分析,适反应pH为5,适反应温度为30℃,比酶活为213.9U·mg-1.[结论]实现重组醇腈酶在大肠杆菌中的高效表达,优化工艺简单可行,酶学性质表征正确,为进一步的酶法制备手性氰醇类化合物奠定基础.
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耐热耐碱木聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达及酶学性质研究
目的 研究枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶基因在大肠杆菌BL2l中的高效分泌表达并对其产木聚糖酶进行酶学性质分析.方法 全基因合成枯草芽孢杆菌木聚糖酶基因序列并进行密码子优化,经大肠杆菌BL2l表达后获得基因工程菌株,通过SDS-PAGE电泳检测、硫酸铵分级沉淀和AKTA系统分离纯化,分析表达产物的酶学性质.结果 重组木聚糖酶为胞外分泌性表达,相对分子质量约43×103;酶促反应适温度为65 ℃,适pH为10.0,适条件下酶活高可达1201.5 IU/ml.结论 成功获得高效分泌表达重组木聚糖酶的基因工程菌株,该木聚糖酶具较好的耐热性和耐碱性.
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重组猪羧肽酶B的酶学性质及稳定性研究
目的 研究重组猪羧肽酶B的酶学性质及稳定性.方法 测定其酶学动力学参数Km和Vmax,适pH和适温度:研究不同pH和不同温度条件下酶的稳定性,以及金属离子和EDTA对酶的活性与稳定性的影响.结果 重组猪羧肽酶B的Km为0.27 mmol/L,Vmax为222.22 μmol/min,适pH为7.65,适催化温度为25℃；pH在5.0～9.0范围内,温度在4～30℃稳定性良好,Cu2+和EDTA抑制酶活性,Co2+促进酶活性.结论 重组猪羧肽酶B的酶学性质与报道的提取猪羧肽酶B的性质基本相同,pH5.0～9.0范围内稳定,在4～30℃时稳定性好.
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噬琼胶卵链菌β-琼胶酶基因YM01-5的克隆表达及其酶学性质的研究
目的 从青岛近海海水中分离鉴定了1株能够降解琼胶的海洋新菌—嗜琼胶卵链菌(Catenovulurna-garivorans gen.nov.sp.nov.)YM01T,并对其进行了全基因组测序.本文对该菌的1个β-琼胶酶基因YM01-5进行了克隆表达,并对重组琼胶酶的酶学性质进行了研究.方法 利用镍柱亲和层析对重组琼胶酶进行了分离纯化,采用DNS法测定重组酶的酶学性质,薄层层析(TLC)和质谱(MS)法对AgaYM01-5的酶解产物进行分析.结果 β-琼胶酶基因YM01-5全长2 412 bp,编码803个氨基酸,预测分子量为91.6 kD,其催化模块属于糖苷水解酶GH50家族.重组琼胶酶YM01-5酶学性质的研究结果表明,该酶的适温度为40℃,适pH为9.0.在35℃以下具有良好的热稳定性,pH 6～10之间保持较高的稳定性,在该范围的pH缓冲液中放置12 h后,YM01-5仍能保持80％以上的酶活力.此外,该重组琼胶酶降解琼脂糖的Km、Vmax值分别为15.6 mg/mL和188 U/mg,对降解产物的薄层层析及质谱分析结果表明,β-琼胶酶基因YM01-5以外切酶的形式作用于琼脂糖产生新琼二糖作为终产物.结论 该酶降解产物单一,有利于琼胶寡糖的制备,具有较高的工业应用潜力,它的发现也为研究菌株YM01中琼脂糖的代谢通路提供了参考.
关键词： β-琼胶酶YM01-5 克隆表达 酶学性质 新琼二糖 -
海洋链霉菌发酵纤溶酶的分离纯化和酶学性质研究
目的 从筛选的1株海洋链霉菌MY0504发酵液中,分离得到1种新型纤溶酶并对其部分酶学性质进行初步研究.方法 采用高速离心、盐析、Sephadex G-75凝胶过滤层析对纤溶酶进行分离纯化;采用纤维蛋白平板法测定纤溶活性,SDS—PAGE电泳测定分子量,小鼠急毒实验检测安全性,并考察温度、pH、金属离子和抑制剂对酶活性的影响.结果 从发酵液提取纤溶酶的纯化倍数为7.15倍,酶活力回收率为32％,其分子量约为14 kD,安全无毒.该酶在47℃以下稳定,适宜pH为7.0～9.0,适pH值为8.0,Cu2+对该纤溶酶抑制作用显著,Ca2+有一定的促进作用.Aprotinin强烈抑制纤溶酶活性,PMSF(苯甲基磺酰氟)可以完全抑制该纤溶酶活性,初步推测该酶是1种丝氨酸蛋白酶.结论 从海洋链霉菌MY0504发酵液中获得1种小分子量纤溶酶,为开发新的溶栓剂提供了新的选择和理论依据.
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固载化木聚糖酶交联酶聚集体的制备及性质
目的 提高木聚糖酶YS1069的稳定性、重复利用率以及便于从反应体系中分离.方法 本文将交联酶聚集体CLEAs技术与载体固定化技术相结合,用LKZ-128氨基型树脂对木聚糖酶CLEAs进行固定化,并对其性质进行初步研究.结果及结论 采用单因素法和响应面法对影响固定化酶活性的因素进行分析和优化,获得佳固定化条件为:pH9.0的酶液,以2 mL的异丙醇为沉淀剂,沉淀1h,以1.59 g/L的京尼平为交联剂,交联2h,20℃的环境中固定化9.25h,加酶量为8 mg时回收率高,达到65.63％,加酶量为60 mg时酶活性高,达到190U/g.重复使用10次后,其相对酶活仍为42.3％,说明具有良好的批次操作稳定性.该酶经过固定化后热稳定性和pH稳定性均得到了提高.
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褐藻酸降解菌的筛选及产酶条件优化
目的 通过对褐藻酸钠的降解实验,从病烂海带上筛选出降解能力较高的菌株,从而制取褐藻酸酶.方法 经过筛选,选出产酶活力高的s4菌株,优化产酶条件,制取粗酶,并对酶的性质进行初步研究.结果 s4菌株佳产酶条件是AlgNa 1.2%,NH4Cl 0.9%,NaCl 1.5%,pH=7.5,温度在25℃佳.结论 s4菌株所产褐藻酸酶具有较高的酶活力和稳定性
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木聚糖酶的纯化与性质研究
木聚糖酶是可将木聚糖降解成为低聚木糖和木糖的复合酶系,在饲料、造纸、食品和酿酒等行业中的应用日益广泛.微生物产生的木聚糖降解酶系较为复杂,在进行酶学性质、分子结构、基因克隆等研究中,分离纯化是研究的前提和基础.作者介绍了色谱法、CBM配基结合法、双水相系统等木聚糖酶纯化技术,并对木聚糖酶的分子量与构成、酶的稳定性和底物特异性等酶学性质进行了综述.
