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miR-17-5p通过靶向作用AKT3抑制肝癌侵袭和迁移
目的 探讨microRNA(miR)-17-5p对肝细胞癌(肝癌)细胞侵袭和迁移的影响及机制.方法 采用RT-PCR检测L-02人正常肝细胞及QGY-7703肝癌细胞中miR-17-5p的表达.miR-17-5p 模拟物和模拟物对照分别转染QGY-7703肝癌细胞.Transwell和划痕试验检测miR-17-5p对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响.生物信息学分析确定miR-17-5p的靶基因,Western blot检测其在肝癌细胞中表达.对靶基因行siRNA沉默后,观察肝癌细胞的侵袭和迁移能力.两种细胞中microRNA比较采用t检验.结果 miR-17-5p在肝癌细胞中表达量为0.16±0.04,较L-02正常肝细胞的1.01±0.19明显下调(t=-9.67,P<0.05).转染miR-17-5p模拟物的肝癌细胞穿膜细胞数、迁移速度分别为(36±4)个、(5.37±0.15)mm/d,明显低于对照组的(62±7)个、(7.50±0.01)mm/d(t=-15.40,-32.00;P<0.05).生物信息学分析显示AKT3是miR-17-5p的关键靶基因,AKT3在肝癌细胞中表达明显低于正常肝细胞.转染siRNA-AKT3的肝癌细胞穿膜细胞数、迁移速度分别为(13±3)个、(4.13±0.15)mm/d,明显低于对照组的(58±3)个、(7.23±0.25)mm/d(t=-17.88,-53.69;P<0.05).结论 miR-17-5p通过靶向作用于AKT3抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力.
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大鼠腓肠肌内蛋白激酶B各亚型表达的年龄差异
目的 研究大鼠腓肠肌内蛋白激酶B(Akt/PKB)各亚型伴随年龄变化的表达差异. 方法 用反转录PCR(RT-PCR)、免疫印迹(western blotting)检测老年组(30月龄)和青年组(6月龄)大鼠腓肠肌内Akt各亚型mRNA和蛋白表达,并统计分析比较. 结果 (1)30月龄组大鼠腓肠肌内Akt1与Akt2的mRNA水平均高于6月龄组(t=7.124,P=0.000;t=2.598,P=0.021),Akt3差异无显著性(t=0.460,P=0.653).(2)两组间Akt1蛋白表达水平无显著变化(t=0.469,P=0 646),30月龄组Akt1的Thr308磷酸化水平低于6月龄组的表达,有显著差异(t=-9.861,P=0.000);30月龄组Akt2的蛋白水平高于6月龄组的表达,有显著差异(t=7.522,P=0.000);Akt3蛋白表达在两组间无差异(t=0.058,P=0.955). 结论 大鼠腓肠肌中Akt三种亚型伴随年龄改变表达存在差异,推测Akt各亚型在此过程中可能发挥不同功效.
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利用TCGA数据集分析AKT3在胃癌中的表达及临床意义
目的：研究AKT3在胃癌中的表达情况，预测并探讨AKT3参与肿瘤发生发展的可能机制及临床价值。方法从癌症基因组图谱（TCGA）数据库收集胃癌数据集，下载AKT3基因表达谱资料及临床信息资料。分析AKT3表达与胃癌临床病理学参数的相关性及对预后的影响。采用基因集富集分析（GSEA）方法预测AKT3的调控基因。结果 AKT3表达水平与肿瘤浸润深度（P=0.001）、TNM分期（P=0.049）、分化程度（P<0.001）相关，肿瘤恶性程度越高，AKT3表达越高。AKT3高表达患者总生存期明显短于低表达患者（P<0.001）。AKT3高表达样本富集了细胞黏附、骨架蛋白调控、紧密连接、TGF?β通路等基因集。结论在胃癌中，AKT3高表达是一种预后不良因素，可以作为预测患者转移发生、判断预后的有效生物标志物。
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Akt3基因敲除对坐骨神经结扎小鼠痛行为学的影响
目的 探讨Akt3基因敲除对坐骨神经结扎小鼠神经病理性痛行为学的影响.方法 C57BL/6小鼠分为Akt3基因敲除组(Akt3-/-,n=12)和野生组(WT,n=12).随机编号后,在小鼠右侧制作坐骨神经慢性挤压(CCI)模型.观察术前1d,术后1,3,5,7,10,14,17,21 d小鼠机械缩足阈值(Pawwithdrawal mechanical threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(Paw withdrawal thermal latency,PWTL).结果 两组小鼠基础PWMT[右侧:(1.09 ±0.20)g,(1.17±0.22)g；左侧:(1.17±0.15)g,(1.22±0.23)g,P＞0.05]和PWTL[右侧:(6.18±1.11)s,(6.20±1.25)s；左侧:(5.82±0.91)s,(5.92±1.71)s,P＞0.05]差异无统计学意义.术后1d,与基础值相比,Akt3-/-组和WT组小鼠右侧足PWMT和PWTL明显降低(P＜0.05),并持续到术后第21天.Akt3-/-组小鼠右侧足PWMT[第3天:(0.42±0.22)g,(0.72±0.36)g；第17天:(0.29±0.15)g,(0.49±0.19)g；第21天:(0.27±0.18)g,(0.56±0.15)g,P＜0.05]和PWTL[第5天:(2.43±0.68)s,(3.13±0.52)s；第17天:(2.43±1.26)s,(3.84±1.29)s；第21天:(2.14±1.23)s,(4.07±1.26)s,P＜0.05]明显低于WT组.Akt3-/-组左侧足PWMT和PWTL与WT组小鼠相比差异无统计学意义(P＞0.05).但是与左侧足相比,Akt3-/-组和WT组小鼠右侧足PWMT和PWTL均明显降低(P＜0.05).结论 Akt3基因敲除后,小鼠坐骨神经结扎诱发的神经病理性疼痛加重.
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miR-582-5p靶向调控AKT3对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨miR-582-5p在人甲状腺乳头状癌(PTC)组织中的表达及其靶向调控AKT3对PTC细胞增殖和凋亡的影响.方法 选取2017年1月至2017年10月海南省肿瘤医院手术切除的PTC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1～2 cm)标本各10例,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p表达;培养人PTC K1细胞,待细胞生长融合度达到50％～60％时分为miR-582-5p mimics组、miR-582-5p反义miRNA寡核苷酸(AMO)组、mimics对照组和AMO对照组,进行细胞转染;细胞转染后,采用实时荧光定量PCR检测4组K1细胞中miR-582-5p表达,四甲基偶氮唑盐法检测4组K1细胞活性,平板克隆形成实验检测4组K1细胞克隆能力,锥虫蓝染色检测4组K1细胞存活率,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记法检测4组K1细胞凋亡情况,Western blot法检测4组K1细胞中miR-582-5p靶基因AKT3蛋白表达.结果 PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p相对表达量分别为0.372±0.237、1.010±0.083,PTC组织中miR-582-5p相对表达量显著低于癌旁组织(P＜0.05).miR-582-5p mimics组、mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中miR-582-5p相对表达量分别为14.143±2.318、1.063±0.214、1.041±0.372、0.435±0.145;miR-582-5p mimics组K1细胞中miR-582-5p相对表达量显著高于mimics对照组、miR-582-5p AMO组和AMO对照组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞中miR-582-5p相对表达量显著低于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞中miR-582-5p相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).细胞培养Oh时4组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P＞0.05).细胞培养12、24、36、48 h时,miR-582-5p mimics组K1细胞活性显著低于miR-582-5p AMO组、mimics对照组和AMO对照组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞活性显著高于mimics对照组和AMO对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组、miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量分别为18.47±5.25、5.10±4.97、19.53±6.45、32.63±7.74;miR-582-5pmimics组K1细胞克隆数量显著少于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量显著多于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞克隆数量比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞存活率分别为(76.46±13.53)％、(42.64±10.85)％、(77.82±10.35)％、(83.63±13.53)％;miR-582-5p mimics组K1细胞存活率显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞存活率显著高于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05);mimics对照组与AMO对照组K1细胞存活率比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞凋亡率分别为(23.35±9.64)％、(42.63±13.38)％、(22.85±9.74)％、(10.84±3.64)％;miR-582-5p mimics组K1细胞凋亡率显著高于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组细胞凋亡率显著低于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P＞0.05).mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量分别为1.000±0.005、0.531±0.162、1.010±0.071、1.432±0.141;miR-582-5p mimics组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P＜0.05),miR-582-5p AMO组K1细胞AKT3蛋白相对表达量显著高于AMO对照组和mimics对照组(P＜0.05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞AKT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 miR-582-5p在PTC组织中表达下调;miR-582-5p可通过靶向调控AKT3的表达而抑制人PTC细胞的增殖,并促进其凋亡.
关键词： miR-582-5p 甲状腺乳头状癌 细胞增殖 细胞凋亡 AKT3 -
AKT3基因重组腺病毒表达载体的构建及其对BT474乳腺导管癌细胞增殖的影响
目的 构建人AKT3基因的重组腺病毒表达载体,探究其对人乳腺导管癌细胞增殖的影响.方法应用RT-PCR方法从流产胎儿脑组织总RNA中扩增出AKT3 cDNA,以XhoⅠ及BglⅡ酶切位点克隆入腺病毒pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体,测序鉴定后与骨架载体PAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,获得重组腺病毒表达载体pAd-AKT3后,转染293A细胞,进行病毒的包装.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,Western印迹方法分析细胞内AKT3蛋白质的表达.通过MTT实验,研究AKT3过表达前后BT474乳腺导管癌细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误.重组腺病毒效价为2.6×108 pfu /ml,重组腺病毒转导后,BT474乳腺导管癌细胞中可检测到AKT3的过表达:Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在BT474细胞中表达良好,而转导空载体腺病毒及未转导细胞对照中未见有此融合蛋白质条带;MTT结果显示AKT3表达上调的重组腺病毒组,其增殖活性显著高于转导空载体腺病毒组及未转导细胞组,差异具有统计学意义(P﹤0.01),而后两者差异无统计学意义(P﹥0.05).结论 成功地构建了AKT3重组腺病毒表达载体,AKT3过表达可增强BT474乳腺导管癌的增殖,为进一步研究AKT3的功能奠定了基础.
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银屑病皮损及正常人皮肤中Akt1,Akt2和Akt3的表达
目的 探讨Akt三种亚型Akt1,Akt2和Akt3的表达在寻常性银屑病发病中的意义.方法 采用免疫组化法检测30例寻常性银屑病皮损及15例正常皮肤中Akt1,Akt2和Akt3的表达,并利用计算机图像采集与分析系统对免疫组化结果进行平均光密度测定.结果 免疫组化结果显示,与正常人表皮相比,寻常性银屑病皮损中Akt1(0.2170±0.0144)和Akt2(0.2157±0.0150)的表达差异无统计学意义(P>0.05),而Akt3(0.2990±0.0165)的表达却明显高于正常皮肤,差异有统计学意义(P<0.01).结论 寻常性银屑病皮损内Akt活性的升高可能与Akt3的表达增强有关.
