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NLRs家族成员NLRC5在免疫反应方面的研究进展
NOD样受体(NLRs)是细胞内感应器,能对各种不同的病原体和细胞内危险信号作出应答,从而诱导固有免疫反应.NLRC5是该家族成员之一,目前已经证实NLRC5是核转录因子κB、Ⅰ型干扰素、炎性体信号路径及MHC-Ⅰ基因表达的重要调节器,在固有免疫反应和适应性免疫反应中发挥举足轻重的作用.本文就NLRC5的相关研究作一综述.
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NLRC5对MHC1的表达调控
NOD样受体（NLRs）是一类重要的病原相关分子模式识别受体（PRR），能识别细胞内的病原体及危险信号从而启动固有免疫应答。NLRC5(NLR family,CARD domain containing 5)作为新近发现的NLRs家族重要一员，因其具有的调控固有免疫及适应性免疫的能力而受到各方的广泛关注。在此，就NLRC5对MHCⅠ（Class I Major Histocompatibility Complex）的调控研究作一综述。
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NLRs家族成员NLRC5在免疫反应方面的研究进展
NOD样受体(NLRs)是细胞内感应器,能对各种不同的病原体和细胞内危险信号作出应答,从而诱导固有免疫反应.NLRC5是该家族成员之一,目前已经证实NLRC5是核转录因子κB、Ⅰ型干扰素、炎性体信号路径及MHC-I基因表达的重要调节器,在固有免疫反应和适应性免疫反应中发挥举足轻重的作用.本文就NLRC5的相关研究作一综述.
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肝细胞癌患者中NLRC5的表达及其临床意义
目的 探讨核苷酸结合结构域受体家族含CARD结构域-5 (NLRC5)在肝细胞癌组织中表达情况及与临床病理特征、预后的关系.方法 采用免疫组化SP法检测94例肝细胞癌组织及其癌旁正常组织中NLRC5的表达;Westemblot检测20例新鲜肝细胞癌组织及其对应的癌旁正常组织中NLRC5的表达.结果 NLRC5在肝细胞癌组织中的阳性率(62.77％)显著高于癌旁正常组织(19.15％,P＜0.01);NLRC5的表达与肝细胞癌分化程度、TNM分期、有无硬化有关(P＜0.05),与患者年龄、性别、AFP值、肿瘤大小、HBV感染、肿瘤包膜是否完整无关(P＞0.05).肝细胞癌组织中蛋白相对表达量(0.280 ±0.049)明显高于相应癌旁正常组织中(0.038±0.009,P＜0.01).NLRC5阳性患者的3年生存期明显低于阴性患者(P＜0.01),并且NLRC5为肝细胞癌预后的独立性危险因素.结论 NLRC5蛋白在肝细胞癌组织中高表达,且与患者的临床病理特征、预后等因素有关,可能在肝细胞癌发生、发展过程中起着重要作用,有望成为肝细胞癌新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点.
关键词： 肝细胞癌 NLRC5 免疫组化学 Western blot 预后 -
TLR2/NLRC5参与棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡及相关机制研究
目的:建立棕榈酸(palmitate acid,PA)诱导体外培养心肌细胞胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)及凋亡模型,检测Toll样受体2(TLR2)和NLRC5在此模型中的表达变化及研究相关的可能机制.方法:用500 μmol/L终浓度的PA处理培养H9C2心肌细胞后采用Annexin Ⅴ/PI双染和流式细胞术分析细胞凋亡情况,并分别采用q-PCR及Western blot方法分析处理后细胞的胰岛素受体(InsR)、CD36、PGC-1α、TLR2、NLRC5、SIRT1、p-AMPK/AMPK的mRNA或蛋白表达变化.结果:与对照组比较,PA处理24 h后H9C2细胞的早、晚期和总凋亡率显著升高,分别为(7.55±3.80)％、(53.84±4.70)％和(61.39±8.54)％(P＜0.05);处理6h后心肌细胞的PGC-1α mRNA相对表达量开始下降(P＜0.05),TLR2和NLRC5则显著升高(P＜0.01),CD36mRNA相对表达量在PA处理14 h时升高(P＜0.05);InsR、SIRT1和AMPK蛋白相对表达量从PA处理8h时开始下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:TLR2/NLRC5参与PA诱导的心肌细胞IR和凋亡,并且可能与AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路的活性下降有关.
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胃癌组织中NLRC5表达的意义及其影响胃癌侵袭转移的可能机制
目的 观察核苷酸结合结构域受体家族含CARD结构域-5(NLRC5)、β-catenin在胃癌组织中的表达情况.分析NLRC5与胃癌临床病理特征及预后的关系.并初步探讨NLRC5与Wnt/β-catenin信号通路间的关系.方法 收集根治性胃癌切除术患者石蜡标本93例,免疫组化检测胃癌组织中NLRC5和β-catenin的表达情况;分析NLRC5的表达与胃癌临床病理特征的关系.采用胃癌细胞株MKN-45和MGC-803分别转染pEGFP-C2-NLRC5重组质粒,qRT-PCR法和Western blot法验证NLRC5转染效率.采用MTT细胞增殖和细胞划痕实验对NLRC5进行功能分析,观察体外实验中NLRC5表达变化对胃癌细胞的生物学行为的影响,采用Western blot法检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的变化.结果 NLRC5在93例胃癌标本中阳性表达67例(72.04％),阴性表达26例(27.96％).NLCR5的表达情况与胃癌的TNM分期、淋巴结转移和复发情况密切相关.Kaplan-merier生存分析结果显示NLCR5阴性表达的患者预后好于阳性表达患者(P＜0.05).93例胃癌标本中β-catenin阳性表达63例(67.74％),阴性表达30例(32.26％).Cox多因素回归分析显示,NLRC5和β-catenin的阳性表达、低TNM分期、淋巴结转移是影响胃癌患者预后的独立危险因素.胃癌细胞在过表达NLRC5后,MTT细胞增殖和划痕实验结果显示,细胞的增殖和迁移能力显著增强(P ＜0.05,P＜0.01),Western blot实验结果显示,Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin和下游关键靶蛋白C-myc、金属基质蛋白酶-7的表达水平明显提高.结论 NLRC5广泛表达于胃癌组织中,其表达与胃癌的TNM分期和淋巴结转移密切相关.Kaplan-merier生存分析显示:NLRC5高表达是影响胃癌预后的危险因素.Cox多因素回归分析显示:NLRC5高表达是影响胃癌预后的独立危险因素.NLRC5与β-catenin的表达呈正相关性,NLRC5的表达变化影响胃癌细胞的生物学行为和Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白的表达.提示NLRC5可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌的浸润和转移.
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稳定表达NLRC5基因肝癌细胞株的建立
目的 建立起能够稳定表达 NLRC5 基因的肝癌HepG2细胞株. 方法 设计遗传霉素( G418 )的浓度梯度,通过对HepG2 细胞筛选终确定筛选药物浓度. 将构建好的人源pEGFP-C2-NLRC5重组质粒利用脂质体介导法转染至HepG2肝癌细胞株中,用G418筛选出耐药阳性克隆. 通过免疫荧光技术观察绿色荧光蛋白稳定表达情况, Western blot法验证NLRC5蛋白表达情况. 结果 G418 在14 d内使HepG2细胞全部死亡的小浓度是300 ng/ml. 用G418筛选瞬转pEGFP-C2-NLRC5 14 d在荧光显微镜下可见耐药克隆的形成. Western blot法检测显示,稳定过表达组 NL-RC5的蛋白水平比空质粒转染组高(t=15. 356,P<0. 05).结论 成功构建稳定表达NLRC5 基因的肝癌细胞株,为进一步研究NLRC5基因在肝癌的体内实验奠定了基础.
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鼠源pEGFP-C2-NLRC5重组质粒的构建及其表达
目的构建鼠源pEGFP-C2-NLRC5表达质粒,并观察其在 RAW264.7细胞中的表达。方法从小鼠巨噬细胞RAW264.7中获得 NLRC5基因的 cDNA,用 EcoR I和BamH I限制性内切酶双酶切后连接至pEGFP-C2载体上。表达载体经PCR、限制性内切酶酶切和DNA序列分析正确后转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达, RT-PCR法鉴定其转录, Western blot法分析其蛋白表达。结果进行双酶切鉴定该质粒可见NLRC5 DNA片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达, RT-PCR法可检测到NLRC5基因的转录, Western blot法可检测到NLRC5蛋白表达。结论成功构建重组pEGFP-C2-NLRC5表达载体, NLRC5蛋白可与绿色荧光蛋白在RAW264.7细胞中融合表达。
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pEGFP-C2-NLRC5重组质粒的构建及其表达
目的构建含NLRC5蛋白功能区的cDNA序列的真核表达载体 pEGFP-C2-NLRC5,并检测其在肾成纤维细胞(COS-7)中的表达。方法采用RT-PCR法从人肝星状细胞(LX-2)中获得 NLRC5蛋白功能区的 cDNA 序列片段,用EcoR玉和BamH 玉双切酶将片段和载体pEGFP-C2双酶切后,酶切产物加入T4连接酶16益连接过夜,构建真核表达载体pEGFP-C2-NLRC5。将构建成功的pEGFP-C2-NLRC5重组质粒经PCR,限制性内切酶酶切和测序鉴定后用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将其转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达, Western blot法鉴定融合蛋白表达。结果阳性克隆经双酶切法鉴定可见NLRC5基因片段。转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,而且主要分布在细胞质中,Western blot法也可检测到在74 ku处有一明显条带,其大小符合EGFP-NLRC5表达的蛋白( NLRC5蛋白大小约为47 ku,EGFP蛋白大小约为27 ku),表明融合蛋白可在哺乳动物细胞中成功表达。结论成功构建pEG-FP-C2-NLRC5质粒, NLRC5蛋白可在 COS-7细胞中成功表达。
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NLRC5在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用机制
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是我国常见的恶性淋巴瘤,大多首发自淋巴结.研究发现,核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLR)家族成员NLRC5在淋巴系细胞中表达明显,其可能是淋巴细胞肿瘤发生的重要基础.并且NLRC5能阻断信号传导途径中的核心组分核转录因子-κB(NF-κB),影响肿瘤发生发展.同时NF-κB的持续活化是DLBCL细胞生存的必要条件.因此,NLRC5很可能具有抑制过度炎症反应,进而抑制DLBCL的功能,其有望成为DLBCL免疫疗法的新靶点.
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NLRC5对HepG2.2.15细胞中MHC-Ⅰ类分子的调节作用
目的 探讨NLRC5在Hep G2.2.15细胞中的表达情况及其对主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(M HC-Ⅰ类分子)表达的调节作用.方法 将实验分为Hep G2组、Hep G2+IFN-γ组、Hep G2.2.15组、Hep G2.2.15+IFN-γ组、Hep G2.2.15+pcDNA3.1-NLRC5-GFP组、Hep G2.2.15+pc DNA3.1组,检测NLRC5转录水平及蛋白表达情况,以及过表达NLRC5后MHC-Ⅰ类分子表达情况.结果 与Hep G2细胞相比,Hep G2.2.15细胞中的NLRC5转录水平、蛋白表达水平、MHC-Ⅰ类分子的表达水平降低(P<0.05).Hep G2细胞加入IFN-γ后,NLRC5的转录水平及蛋白表达水平均增加(P<0.05),Hep G2.2.15细胞蛋白水平无明显变化.与未转染组相比,过表达NLRC5蛋白后的Hep G2.2.15细胞表面的MHC-Ⅰ类分子表达上调(P<0.05).结论 HBV感染导致MHC-Ⅰ类分子表达下调,而NLRC5可上调MHC-Ⅰ类分子的表达.
