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HBx致肝细胞癌分子机制的研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我国肝细胞肝癌(HCC)发生的主要原因之一.一些体内外研究发现,乙型肝炎病毒x(HBx)可诱导肝细胞的恶性转化及癌变,成为目前研究乙肝相关性肝细胞癌发生机制的热点.近来在HBx与抑癌基因,如p53的新成员p73以及p16,p21等之间的相互作用及其对肝细胞恶性转化与癌变的影响等方面的研究也取得初步成果,但其关系错综复杂,这方面不断的深入研究将有助于进一步揭示HBx致肝细胞癌发生的分子机制,对探寻乙肝相关性肝癌新的防治策略具有重要意义.
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肝细胞癌中HBx蛋白与生存素蛋白表达的关系及其意义
目的:探讨乙型肝炎病毒X 蛋白(HBx)与生存素在肝细胞癌(HCC)表达发生中的作用.方法:采用免疫组织化学测定58 例患者的HCC 组织中HBx 蛋白和生存素蛋白表达,用含有辣根过氧化物酶底物的试剂合(DAB)显色,已知的肝癌组织HBx 及生存素阳性切片为阳性对照,磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照.结果:HCC 组织HBx 和生存素的表达率分别为46.6%(27/58)和69.0%(40/58),HBx 蛋白阳性的HCC 组织中生存素蛋白阳性表的阳性率为70.4%(19/27),HBx 蛋白的阴性的HCC 组织中生存素蛋白阳性表的阳性率为27.5%(11/40),差异有统计学意义(P＜0.05);HBx 蛋白与生存素蛋白表达与HCC 分化程度、转移及甲胎蛋白(AFP)相关.结论:在HCC 的发生过程中HBx 蛋白可上调生存素蛋白的表达,促进肝细胞癌的发生发展.
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乙肝病毒X蛋白对正常肝细胞生物钟基因表达的影响
目的:探讨乙肝病毒X蛋白(HBx)对人正常肝细胞中生物钟基因表达的影响.方法:分别将HBx表达质粒(pcDNA3.1-HBx)与空载体质粒(pcDNA3.1)转染入人正常肝细胞系L02后,用RT-PCR与Western blot法检测细胞HBx mRNA与蛋白的表达;real-time PCR检测细胞中生物钟基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε的表达.结果:RT-PCR与Western blot结果显示,L02细胞转染HBx表达质粒后有明显的HBx mRNA与蛋白表达,而转染空载体质粒的L02细胞无HBx mRNA与蛋白表达.与转染空载体质粒的L02细胞比较,转染HBx表达质粒的L02细胞CLOCK与Cry1的mRNA表达明显升高,而BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry2、CKIε的mRNA表达明显降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论:HBx能使正常肝细胞中的生物钟基因表达发生改变,破坏肝细胞正常的生物节律,这可能为其导致肝癌形成的机制之一.
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不同方法HBx基因表达质粒转染肝癌HepG2细胞的效果比较
目的:比较Lipo2000、磷酸钙法和Lonza电转法转染乙型肝炎病毒X(HBx)基因的表达质粒pHA-HBx至HepG2肝癌细胞的转染效率及其细胞毒性.方法:分别用Lipo2000、磷酸钙法和Lonza电转法将绿色荧光蛋白(GFP)标记的pHA-HBx转染至HepG2肝癌细胞,以荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR鉴定HBx基因在HepG2细胞基因组的整合,Annexin V/PI法检测细胞的存活情况.结果:RT-PCR结果显示,外源性HBx基因通过3种转染方法均可导入HepG2细胞并表达;Lipo2000和Lonza电转法的转染效率均高于磷酸钙法(均P＜0.05),而Lipo2000和Lonza电转法的转染效率间差异无统计学意义(P＞0.05);细胞存活率从高到低依次为Lonza电转法、Lipo2000、磷酸钙法(均P＜0.05).结论:Lonza电转法转染pHA-HBx至HepG2肝癌细胞转染效率高,且细胞毒性小,是较好的转染方法.
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乙型肝炎病毒X基因经p53依赖性与非依赖性途径对p21WAF1表达的影响
背景与目的:研究表明,在不同情况下乙型肝炎病毒 X基因(HBx)对 p21WAF1的表达具有不同的影响,但作用机制仍不清楚.本研究的目的是探讨 HBx对 p53下游基因 p21WAF1的影响.方法:通过正、反义野生型 p53(wtp53)与 HBx单转染及共转染人肝癌细胞株 SMMC-7721细胞,以及 HBx转染不同内源性 p53状态的肝癌细胞株,检测 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达,并用流式细胞仪观察细胞周期的变化 ,Western blot法比较 p53、p21WAF1表达水平的变化.结果:正、反义 wtp53与 HBx 单转染及共转染 SMMC-7721细胞 ,HBx与正义 wtp53共转染组(1.007± 0.098)与单转染正义 wtp53(0.490± 0.012)相比,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显升高(P< 0.05),其余各组 HBx均可导致 p21WAF1启动子荧光素酶基因表达明显减少(P< 0.05).Western blot法表明 HBx可导致 p53的表达增加,但 p53表达较低的 SMMC-7721细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达减弱 ,p21WAF1启动子荧光素酶基因表达(0.053± 0.010)也较对照组(0.094± 0.013)明显减少(P< 0.05),而 p53表达较强的 HepG2细胞转染 HBx后 p21WAF1蛋白的表达增强、p21WAF1启动子荧光素酶基因的表达(1.252± 0.052)较对照组明显升高(0.767± 0.031)(P< 0.05).细胞周期结果表明瞬时转染 HBx的 SMMC-7721和 Hep3B细胞停滞在 G0-G1期细胞数(42.31%、36.96%)较对照组(47.10%、42.90%)减少,而瞬时转染 HBx的 HepG2细胞(63.62%)停滞在 G0-G1期的细胞数较对照组(57.42%)增加,但稳定筛选后 ,pcDNA3HBxHepG2细胞(57.31%)停滞在 G0-G1期细胞数较对照组(61.49%)减少.结论:HBx一方面可能引起 p53蛋白在细胞内积聚导致 p21WAF1表达升高,另一方面可直接抑制 p21WAF1启动子的转录活性.
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HBxAg对胎盘滋养细胞凋亡的影响及其作用机制
目的 探讨乙型肝炎病毒X(HBx)蛋白对胎盘滋养层细胞凋亡水平的影响及可能的作用机制.方法 将已构建好的HBx基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx瞬时转染人绒毛膜癌细胞株JEG-3及HTR-8,分别以转染空载体pcDNA3.1(+)和未转染作为阴性对照组和空白对照组,转染后48 h,以逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)鉴定HBx-mRNA,间接免疫荧光法和蛋白印迹法(Western blot)鉴定HBxAg的表达;流式细胞仪AnnexinⅤ+PI双染方法检测细胞凋亡状态;间接免疫荧光法、流式细胞仪及Western blot检测PI3K、pAKT的表达.结果JEG-3及HTR-8转染组中均有HBx蛋白表达,而在对照组未被检测到;转染组JEG-3、HTR-8细胞早期凋亡率小于阴性对照组(P<0.05),PI3K和pAKT1的表达水平高于阴性对照组(P<0.05),然而AKT1蛋白表达水平在转染组、阴性对照组和空白对照组间无显著性差别.结论 HBx 基因可以成功地转入 JEG-3 及 HTR-8 细胞,HBx 转染后可抑制滋养细胞凋亡,这可能与 HBx 激活 PI3K/pAKT 信号通路有关.
