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视黄醇类X受体激动剂抑制高糖诱导内皮细胞氧化应激
背景 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是在高糖环境下内皮细胞活性氧离子(ROS)产生的重要来源,视黄醇类X受体(RXR)能够抑制高糖诱导下内皮细胞ROS的生成,但对NADPH氧化酶的表达水平的影响尚不清楚.目的 探讨高糖干预下血管内皮细胞NADPH氧化酶NOX4、gp91 phox和p22Phox亚基表达水平的变化及RXR激动剂的影响.方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)、以33 mmol/L葡萄糖干预,模拟糖尿病患者体内环境,通过流式细胞学方法检测细胞内的ROS水平,采用干扰RNA(siRNA)技术检测NADPH氧化酶NOX4、gp91 pbox和p22pbox亚基在高糖诱导下内皮细胞产生氧化应激反应中的作用,分别应用实时荧光定量PCR和免疫印迹杂交的方法检测NADPH氧化酶各亚基的表达水平.结果 高糖处理后HUVECs内ROS的水平显著增加(6.58±0.24对2.47±0.12,P＜0.05).siRNA检测结果显示NOX4、gp91phox和p22phox亚基参与了高糖诱导下HUVECs内ROS的生成过程.高糖处理显著上调NADPH氧化酶NOX4、gp91phox和p22 phox亚基的mRNA水平(NOX4:0.390±0.020比0.110±0.006,P＜0.05;gp91phox:0.480±0.040比0.090±0.005,P＜0.05;p22phox:0.025±0.002比0.005±0.001,P＜0.05)和蛋白水平.RXR激动9-cis-RA和SR11237抑制高糖诱导下ROS生成,以及NADPH氧化酶NOX4、gp91phox和p22 phox各亚基mRNA和蛋白水平的表达.结论 RXR激动剂通过下调高糖诱导下内皮细胞NADPH氧化酶的表达,对抗高糖诱导内皮细胞产生的氧化应激反应.
关键词： 视黄醇类X受体 高糖 氧化应激 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 -
视黄醇类X受体激动剂通过抑制蛋白激酶C的激活抑制高糖诱导的人急性单核细胞白血病细胞氧化应激反应
目的 探讨视黄醇类X受体(RXR)激动剂对高糖诱导人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)产生的氧化应激的影响及作用机制.方法 体外培养THP-1,以25 mmol/L葡萄糖干预,模拟糖尿病患者体内环境,通过流式细胞仪和荧光显微镜的方法检测细胞内的活性氧族水平.分别应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹的方法检测THP-1烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基NOX2/gp91phox和p22phox的表达水平,用免疫印迹方法检测蛋白激酶C(PKC)蛋白的磷酸化水平.结果 在高糖环境下(葡萄糖终浓度为25 mmol/L),THP-1内活性氧族生成明显增加(9.54±0.49比2.3±0.58,P＜0.05),NADPH氧化酶NOX2/gp91phox和p22phox亚基的mRNA和蛋白表达水平明显上调.RXR激动剂9顺式维甲酸(9-cis- RA)可明显抑制高糖诱导的活性氧族生成及NADPH氧化酶NOX2/gp91 phox和p22phox亚基表达水平的增加幅度,且具有浓度依赖性；10-7 mol/L浓度的SR11237(RXR的特异性配体)与等浓度9- cis- RA具有相似的抑制效应.PKC抑制剂LY3335(20 μmol/L)明显抑制高糖环境下活性氧族的生成及NADPH氧化酶NOX2/gp91phox和p22phox亚基蛋白表达水平的增加幅度.RXR激动剂9-cis-RA和SR11237可抑制高糖诱导的PKC蛋白的磷酸化.结论 PKC的活化参与了高糖诱导THP- 1产生的氧化应激反应,RXR激动剂通过抑制PKC蛋白的活化对抗高糖诱导THP-1产生的氧化应激反应.
关键词： 视黄醇类X受体 人急性单核细胞白血病细胞 蛋白激酶C 高糖 氧化应激 -
视黄醇X受体激动剂蓓萨罗丁抑制糖尿病载脂蛋白E-/-小鼠动脉粥样硬化的形成及其机制
目的 观察视黄醇类X受体(RXR)激动剂蓓萨罗丁(bexarotene,Bex)对链尿左菌素(streptozotocin,STZ)诱导的载脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响,探讨RXR激动剂抗动脉粥样硬化的相关机制.方法 选取C57BL/6小鼠8只作为空白对照组,46只apoE-/-小鼠简单随机抽样法分为4组:apoE-/-组(n=10),STZ+ apoE-/-组(n=12),STZ+ apoE-/-+Bex 10 mg·kg-1·d-1组(n=12),STZ+apoE-/-+Bex 30 mg·kg-1·d-1组(n=12).STZ腹腔注射法建立糖尿病动物模型,测定其血糖及血脂水平,HE染色检测胸主动脉斑块面积.Western blot法测胸主动脉RXRα及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶gp91phox亚基蛋白的表达;Fenton反应及Griess显色测定血清及胸主动脉匀浆上清液活性氧(ROS).结果 (1)apoE--组胸主动脉斑块面积大于C57BL/6组[(38.40 ±8.95) μm2比(0.10 ±0.01) μm2,P＜0.01].(2)STZ+ apoE-/-组的胸主动脉斑块面积大于apoE-/-组[(94.06±8.04)μm2比(38.40±8.95) μm2,P＜0.05],血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、胸主动脉gp91phox亚基表达水平、血清及胸主动脉ROS水平均高于apoE-/-组(P均＜ 0.05).(3)STZ+ apoE-/-+Bex 10 mg·kg-1·d-1组胸主动脉斑块面积小于STZ+ apoE-/-组[(78.72 ±4.62) μm2比(94.06±8.04) μm2,P＜0.05],血糖、TG、TC、LDL-C与STZ+ apoE-/-组比较差异无统计学意义(P＞0.05),gp91phox表达、血清及胸主动脉ROS水平低于STZ+ apoE-/-组(P＜0.05).(4)STZ +apoE-/-+Bex 30 mg·kg-1·d-1组胸主动脉斑块面积小于STZ+ apoE-/-+ Bex 10 mg·kg-1·d-1组[(46.13 ± 7.56) μm2比(78.72±4.62)μm2,P＜0.05],血糖、TG、TC、LDL-C、胸主动脉gp91phox表达、血清及胸主动脉ROS水平均低于STZ+apoE-/-组(P均＜0.05).结论 RXR激动剂Bex显著抑制STZ诱导的apoE--小鼠动脉粥样硬化的形成,其机制可能与抑制氧化应激反应及降低血糖、改善血脂代谢等有关.
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激活视黄醇类X受体对氧化型低密度脂蛋白诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7向树突样细胞分化的影响
目的 探讨激活核受体视黄醇类X受体(RXR)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞向树突状细胞分化的影响及其机制.方法 小鼠巨噬细胞系RAW264.7经ox-LDL诱导48 h后分化为树突样细胞,相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标志物,CM-H2DCFDA荧光探针测定细胞内活性氧浓度.结果 ox-LDL诱导48 h后,表达与树突状细胞免疫成熟和激活有关的细胞表面标志物CD40、CD86、CD83、MHC Class Ⅱ和CD1d的RAW264.7细胞比例明显升高,同时给予天然型RXR特异性配体9-cisRA(10-7 mol/L)上述比例分别下降约47%、43%、48%、32%和17%,同时给予合成型RXR特异性配体SR11237(10-6 mol/L)上述比例分别下降约38%、38%、46%、36%和32%,并且均表现剂量依赖性.相差显微镜观察发现树突样细胞形态改变也得到部分抑制.ox-LDL引起细胞内活性氧浓度显著升高[平均荧光强度(MFI)38.24±4.20比4.46±0.39,P＜0.05],同时给予9-cisRA(10-7 mol/L)或SR11237(10-6 mol/L)MFI分别降低到12.60±1.52和17.89±1.91,较ox-LDL单独处理组差异有统计学意义(P＜0.05).结论 激活核受体RXR能够部分抑制ox-LDL诱导巨噬细胞向树突状细胞分化,其机制可能与减轻细胞氧化应激损伤有关.
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激活视黄醇类X受体抑制轻度氧化低密度脂蛋白诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7增殖
目的 探讨激活视黄醇类X受体(RXR)对轻度氧化低密度脂蛋白(LoxLDL)诱导巨噬细胞增殖的影响及其作用机制.方法 饥饿处理后的小鼠巨噬细胞系RAW264.7经LoxLDL(20μg/ml)刺激24 h诱导细胞增殖,干预组同时给予不同浓度的RXR特异性激动剂顺式维甲酸9(9-cisRA),四甲基偶氮唑蓝方法检测细胞活力,脱氧尿嘧啶核苷免疫组化方法检测细胞DNA合成,流式细胞仪PI单染法检测细胞凋亡,Western印迹方法检测Nur77和RARB蛋白表达.结果 LoxLDL诱导24 h后,细胞活力和DNA合成(A值)分别升高0.79±0.12和1.81±0.31,RXR的特异性配体9-cisRA能够显著抑制LoxLDL的作用,在10-8mol/L和10-7mol/L浓度分别使细胞活力下降到0.43±0.10和0.26±0.07(P＜0.05),DNA合成升高为1.14±0.43和0.72±0.06(P＜0.05),且对细胞凋亡没有影响.Western印迹检测表明,孤儿核受体Nur77蛋白表达在LoxLDL刺激后显著升高5倍以上,9-cisRA显著下调Nur77表达,同时上调下游靶基因RARB蛋白表达.结论 激活核受体RXR能够显著抑制LoxLDL刺激引起的巨噬细胞增殖,其机制可能与调控RXR/Nur77异源二聚体及其下游靶基因RARβ有关.
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视黄醇类X受体激动剂通过抑制Rac-1蛋白的激活对抗高糖诱导内皮细胞产生的氧化应激反应
目的 探讨视黄醇类X受体激动剂能否对抗高糖环境诱导人血管内皮细胞产生的氧化应激反应及Rac-1蛋白在黄醇类X受体激动荆抗氧化应激过程中的作用.方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞,以葡萄糖(33 mmol/L)干预模拟糖尿病患者体内环境,通过流式细胞学和激光共聚焦显微镜的方法 检测细胞内的活性氧离子水平,化学发光法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性.用GST pull-down和免疫杂交的方法 检测Rac-1蛋白的激活.结果 (1)高糖干预显著增加内皮细胞内活性氧离子水平及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(2)Rac-l蛋白抑制剂NSC23766显著降低高糖诱导下内皮细胞活性氧离子的生成及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(3)视黄醇类X受体激动剂9顺维甲酸和SR11237显著下调高糖环境下内皮细胞内活性氧离子水平及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性;(4)视黄醇类X受体激动剂9顺维甲酸和SR11237抑制高糖干预对内皮细胞Rac-1蛋白的激活.结论 视黄醇类X受体激动剂通过抑制Rac-1蛋白的激活对抗高糖诱导内皮细胞产生的氧化应激反应.
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9-顺式维甲酸抑制佛波酯诱导人单核细胞系THP-1向巨噬细胞分化
目的 探讨视黄醇类x受体特异性激动剂9-顺式维甲酸对佛波酯诱导人单核细胞系THP-1向巨噬细胞分化的影响.方法 体外培养人单核细胞系THP-1,经佛波酯诱导分化为巨噬细胞,同时给予9-顺式维甲酸对佛波酯诱导分化进行干预,通过相差显微镜观察细胞形态,MTF比色法检测细胞贴壁率,流式细胞仪检测与单核,巨噬细胞分化有关的细胞表面标志物CD11b和CD36的表达.结果 9-顺式维甲酸干预后梭形、分支状细胞明显减少,与佛波酯单独作用组相比细胞贴壁率减少50%(P＜0.01),细胞表面标志物CD11lb和CD36分别减少50%和28%(P＜0.01).结论 视黄醇类X受体特异性激动剂9-顺式维甲酸可明显抑制佛波酯诱导人单核细胞系THP-1向巨噬细胞分化.
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激活视黄醇类X受体对氧化型低密度脂蛋白诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7凋亡的影响
目的 探讨激活视黄醇类X受体对氧化型低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡的影响及其机制.方法 小鼠巨噬细胞系RAW264.7经氧化型低密度脂蛋白处理24 h诱导凋亡,同时观察给予视黄醇类X受体特异性配体9-cisRA或SR11237对氧化型低密度脂蛋白诱导凋亡的干预作用,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪PI单染法和DAPI染色检测细胞凋亡,CM-H2DCFDA荧光探针测定细胞内活性氧浓度.结果 RAW264.7细胞经氧化型低密度脂蛋白(100 mg/L)处理24 h后细胞活力较对照组下降约60%,细胞凋亡百分率较对照组升高约75%,10-8mol/L和10-7 mol/L9-cisRA及10-7 mol/L SR11237能够显著抑制氧化型低密度脂蛋白诱导引起的细胞活力下降和凋亡(P＜0.05).给予氧化型低密度脂蛋白(100 mg/L)4 h后细胞内活性氧水平显著升高约17倍以上,如联合给予9-cisRA(10-7 mol/L)或SRll237(10-6 mol/L),平均荧光强度分别下降约52%和28%,较氧化型低密度脂蛋白单独处理组有显著性差异(P＜0.05).结论 激活视黄醇类X受体能够抑制氧化型低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡,其机制可能与减轻细胞氧化应激损伤有关.
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9-顺式维甲酸部分抑制脂多糖诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7向树突样细胞分化
目的 探讨激活视黄醇类X受体对脂多糖诱导巨噬细胞向树突状细胞分化的影响及其机制.方法 小鼠巨噬细胞系RAW264.7经脂多糖诱导48 h后分化为树突样细胞,观察同时给予视黄醇类X受体激动剂9-顺式维甲酸对脂多糖诱导分化的干预作用并检测细胞内活性氧的生成,相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测与树突状细胞免疫成熟和激活有关的细胞表面标志物(CD40、CD86和CD83),CM-H2DCFDA荧光探针测定细胞内活性氧浓度.结果 9-顺式维甲酸部分抑制脂多糖诱导出现的树突样细胞形态改变,使被脂多糖诱导上调的细胞表面标志物CD40、CD86和CD83分别下降约50%、40%和38%,作用表现剂量依赖性;脂多糖引起细胞内活性氧浓度显著升高(平均荧光强度98.9±9.6比12.3±1.8,P＜0.05),9-顺式维甲酸在10-8 mol/L和10-7 mol/L剂量水平分别降低平均荧光强度到69.4±5.8和37.0±4.2,较脂多糖单独处理组差异有显著性(P＜0.05).结论 激活视黄醇类X受体能够部分抑制脂多糖诱导巨噬细胞向树突状细胞分化,其机制可能与减轻细胞氧化应激损伤有关.
