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日本血吸虫29000膜外蛋白的表达和纯化及功能初步鉴定
随着血吸虫病防治工作的不断深入及血防形势的改变,血吸虫病流行的特点对本病的诊断提出了更高的要求.因表膜蛋白更易接触机体的免疫系统,刺激机体产生相对应的抗体,大多研究都支持虫体的表膜蛋白较其他蛋白有较好的诊断价值.本课题组将日本血吸虫(Schistosoma japouicam,Sj)中国大陆株29 000表膜蛋白的膜外区基因体外重组并表达,纯化后初步鉴定其免疫原性和免疫反应性,希望可用于日本血吸虫病的免疫诊断和疗效考核.
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日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚基的序列分析
目的发现并克隆日本血吸虫新基因.方法对已获得的日本血吸虫表达序列标签(EST)进行同源性分析,识别血吸虫新基因;根据EST设计引物,用3′RACE从mRNA中扩增获得新基因全长,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能分析,将新基因的完整编码阅读框克隆入原核表达载体pGEX-4T-1.结果用3′RACE获得一个EST的3′端所缺序列,得到完整编码阅读框,其开放阅读框(ORF)654bp,编码217个氨基酸.利用生物信息学技术确定其为日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位的编码基因.重组质粒经双酶切及测序鉴定,证明日本血吸虫CKⅡβ原核表达质粒构建成功.结论扩增并成功克隆日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位编码基因的全长cDNA,为进一步的功能研究打下基础.
关键词: 日本血吸虫 大陆株 酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位 克隆 序列分析 -
用表达序列标签(EST)法发现日本血吸虫新基因的研究
日本血吸虫基因组计划的研究有助于我们从多方面了解血吸虫这种复杂的多细胞生物,以促进抗血吸虫疫苗的研制,寻找新的杀虫药物以及研究血吸虫与宿主的关系.表达序列标签法(EST)是一种快速筛选生物新基因的常用方法.本文运用这种技术对日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库进行随机挑选,提取噬菌体DNA作模板,进行PCR反应,将产物大于500 bp cDNA插入片段测序,得到115个表达序列标签(EST),其中有75个新基因,并得到一些有重要功能cDNA的克隆.
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日本血吸虫22.6kDa重组蛋白对小鼠的免疫保护性研究
目的研究日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa抗原作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能,并探讨Sj22.6/Sj26 GST融合蛋白作为复合疫苗的可能性.方法用亲和层析法制备Sj22.6/Sj26 GST融合蛋白.将这两种蛋白分别免疫BALB/c小鼠后进行攻击感染试验.结果 Sj22.6重组蛋白和Sj22.6/Sj26 GST融合蛋白分别可诱导小鼠产生32.1%(P<0.005)和34.9%(P<0.02)的成虫减虫率,28.4%(P<0.02)和45.1%(P<0.005)的总减卵率.结论 Sj22.6与Sj22.6/Sj26GST融合蛋白均有疫苗应用价值.
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日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析
目的识别和克隆日本血吸虫新基因.方法对本实验室获得的EST进行同源性分析,识别血吸虫新基因;根据EST设计引物,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA,并将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析.结果EST同源性分析得到一个完整编码基因,开放阅读框(ORF)495bp,编码164个氨基酸;锚着PCR法获得另一EST的3'端所缺序列,得到完整编码阅读框,其ORF 999bp,编码332个氨基酸.利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶(LDH)的编码基因.重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功.结论克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA,为进一步的功能研究打下了基础.
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日本血吸虫精氨酸酶基因启动子序列的扩增及序列分析
目的获取日本血吸虫(Sj)精氨酸酶(ARG)新基因的DNA编码序列及其启动子序列,实验验证ARG基因编码序列的完整性.方法 以日本血吸虫成虫 DNA做模板,PCR扩增 ARG基因编码区的DNA序列并测序;根据Sj ARG基因已扩增的 DNA序列设计2条巢式引物,用TaKaRa LA Taq PCR Cloning in vitro Kit,扩增 Sj ARG基因的启动子序列;对已扩增得到的序列进行 TATA盒的寻找以分析启动子序列的位置,实验验证我们曾获取的 Sj ARG新基因编码序列的完整性. 结果 扩增得到长约 1 000bp ARG基因 DNA序列 , Sj ARG基因 DNA序列内没有内含子,与 cDNA序列完全一致.对启动子序列扩增后,得到一略大于 250bp的序列,测序后分析发现其中有 36bp与 ARG基因 DNA序列的 5′端重叠.因此 ,将精氨酸酶基因的 DNA序列又向前延伸了 221bp,与前面得到的序列拼接后得到一条 1 486bp的总序列,将该序列在 NCBI上进行 ORF的寻找发现其长的 ORF达 1 164bp,起始密码子在第 156位,终止密码子在第 1 319位 ,该起始密码子前 32位为 TATA盒的位置.因此,确定该 Sj ARG基因全长 cDNA编码序列长应为 1 164bp.结论 成功扩增获得了日本血吸虫精氨酸酶基因编码区的 DNA序列,其不含有内含子;并扩增得到了该基因的启动子序列,从而获得了 Sj ARG基因真正的全长 cDNA序列,为进一步的功能鉴定奠定了基础.