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他汀类药物对高磷介导血管平滑肌细胞成骨细胞转分化和钙化的影响
目的 探讨他汀类药物对高磷介导血管平滑肌细胞成骨细胞转分化和钙化的影响.方法 将体外培养的人主动脉平滑肌细胞(HASMC)分成对照组(常规Medium 231培养基)、正常磷浓度组(Pi1.5mmol/L)和高磷组(Pi2.5mmmol/L).Real-time PCR测定干预72h后细胞的核结合因子α(cbf α)和骨桥蛋白(OPN)水平,测定干预14d后上清液的钙浓度.HASMC在浓度为0.1umol/L的阿托伐他汀和2.5mmol/L的Pi培养基中共同孵育14d后,检测HASMC的钙含量.结果 培养72h后,cbf-α在Pi 2.5mmol/L组的mRNA表达明显高于对照组[(50.02±0.38)vs(1.02±0.35),P＜0.001],而Pi 1.5mmol/L组与对照组无明显差别[(1.07±0.15)vs(1.02±0.35),P＞0.05].Pi 2.5mmol/L组的OPN表达亦明显高于对照组[(14.62±0.35)vs(1.05±0.16)],而Pi 1.5mmol/L组与对照组无明显差别[(0.99±0.10)vs(1.05±0.16)].高磷组钙含量明显高于对照组[(115±2.43)vs(4.08±0.32),P＜0.001],而Pi 1.5mmol/L组与对照组相比无明显变化[(5.01±0.21)vs(4.08±0.32),P＞0.05].阿托伐他汀能使高磷诱导HASMC的钙沉积明显减少[(115±2.43)vs(58±2.65)ug/mg蛋白,P＜0.01].结论 高磷作用能明显增加HASMC的cbf α-1的表达,明显增加HASMC成骨细胞标志性蛋白OPN的表达,使HASMC向成骨细胞转分化,进而促进HASMC钙化;阿托伐他汀能抑制高磷诱导的HASMC的钙化作用.
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人主动脉夹层组织Myc associated factor X的表达及其生物学功能
目的 观察入主动脉夹层组织中Myc associated factor X (MAX)的表达情况,并探讨其相关生物学功能.方法 采用荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹检测MAX在15例主动脉夹层组织中的表达情况.通过腺病毒载体转染人主动脉平滑肌细胞使其过表达MAX,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式细胞仪等技术明确过表达MAX对主动脉平滑肌细胞增殖、凋亡的影响.结果 夹层主动脉组织中MAX的mRNA和蛋白表达水平均高于正常主动脉组织.过表达MAX可以抑制主动脉平滑肌细胞增殖,并促进其凋亡(P＜0.05).结论 MAX可能通过调控主动脉平滑肌细胞增殖、凋亡诱导其丢失,进而参与主动脉夹层的发生、发展.
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SMAD4低表达促进人血管平滑肌细胞迁移和凋亡
目的:观察SMAD4表达下调对人主动脉血管平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)迁移及凋亡的影响.方法:以siRNA-SMAD4转染HASMC,抑制SMAD4表达,以细胞迁移实验(Transwell)和流式细胞术检测平滑肌细胞的迁移和凋亡率;蛋白质印迹法检测各凋亡相关蛋白的表达.结果:与阴性对照组相比,转染siRNA-SMAD4后HASMCs 早期和晚期细胞凋亡率均明显升高(P 均 <0.05).Transwell 实验结果显示,siRNA-SMAD4组平均每视野迁移细胞数为114 ± 21,明显多于空白组和阴性对照组(分别为19 ± 6,25 ± 7,P均<0.01).蛋白质印迹结果显示SMAD4低表达引起Cleaved Caspase-3表达上调、Bal-2表达下调.结论:SMAD4低表达明显促进HASMC迁移和凋亡,有可能与主动脉瘤发生发展的病理机制相关.
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穹窿主体蛋白对血管平滑肌细胞增殖的影响
目的:探讨穹窿主体蛋白(major vault protein,MVP)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响.方法:分离培养野生型小鼠VSMCs,用血小板源性生长因子(PDGF-BB)或15％胎牛血清(FBS)刺激VSMCs增殖,Western blot检测VSMCs的MVP表达水平,同时检测特异性分化标记物α-SMA和SM22α表达水平.然后用PDGF-BB刺激人主动脉平滑肌细胞(HAoSMCs),检测MVP的表达差异.再分别分离培养野生型小鼠和MVP敲除型小鼠的VSMCs,通过CCK8细胞增殖实验检测两者的增殖能力;同时用siRNA干扰的方法,使HAoSMCs中MVP低表达,检测其增殖能力的变化.结果:用PDGF-BB或15％ FBS刺激VSMCs后,MVP表达水平呈浓度和时间依赖性下降,α-SMA和SM22α表达水平也相应降低.MVP缺失或低表达情况下,VSMCs的增殖能力均下降.结论:MVP在VSMCs增殖中起了重要作用.
关键词： 穹窿主体蛋白 小鼠主动脉平滑肌细胞 人主动脉平滑肌细胞 增殖 -
人主动脉平滑肌细胞感染甲型和乙型流感病毒后细胞因子表达的变化
目的 血管平滑肌细胞为动脉粥样硬化(AS)病变组织的主要细胞之一.流感病毒对人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)的感染及对其细胞因子表达的影响报道较少.文中旨在探讨甲型流感病毒(IAV)和乙型流感病毒(IBV)感染HASMCs及对其细胞因子表达的影响.方法 采用IAV和IBV刺激HASMCs,分别为甲型组、乙型组,另设对照组(不加病毒).免疫荧光法检测细胞内流感病毒核蛋白表达,CCK8法检测细胞增殖,甲型组、乙型组取上清液分别加入正常培养基和病毒生长液,RT-PCR检测流感病毒RNA水平的变化,并用收集的上清液感染MDCK细胞,检测流感病毒核蛋白.RT-PCR检测感染流感病毒24 h后细胞因子的表达变化.结果 CCK8实验结果显示,HASMCs感染流感病毒后第3、4天,甲型组、乙型组细胞增殖较对照组明显减慢(P＜0.05).第3天,乙型组细胞上清RNA表达量较第2天明显增加(P＜0.05),第4天细胞上清RNA表达量较第3天明显下降(P＜0.01).甲型组正常培养基、病毒生长液IAV RNA水平分别为0.842±0.148、15.182±1.932,差异有统计学意义(P＜0.01).乙型组正常培养基、病毒生长液IBV RNA水平分别为0.962±0.033、4.029±0.681,差异有统计学意义(P＜0.01).甲型组、乙型组MCP-1的相对表达量[(4.364±0.193)、(3.348±0.507)]较对照组(1.001±0.001)均明显增高(P＜0.05);IL-6、TNF-α 亦明显增高(P＜0.05).结论 IAV、IBV均可感染HASMCs,并引起AS相关细胞因子(IL-6、TNF-α、MCP-1)表达的增加,为流感病毒感染导致AS的机制研究提供了理论依据.
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人骨生成诱导因子基因慢病毒载体构建及在人主动脉平滑肌细胞中稳定过表达
目的:构建人骨生成诱导因子基因(osteoinductive factor,OIF)慢病毒载体,并在人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)中稳定过表达OIF.方法:PCR扩增OIF-3FLAG,并克隆到慢病毒载体pMSCV PIG中,构建慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,并测序鉴定.应用脂质体将pMSCV PIG-OIF-3FLAG或pMSCV PIG与VSVG、GAG-POL共转染293T细胞,48 h后收集细胞上清,感染HASMC,48 h后加入嘌呤霉素4 d,即筛选出稳定过表达pMSCV PIG-OIF-3FLAG的HASMC细胞株,采用real-time PCR和Western blot检测OIF mRNA和蛋白表达.结果:构建OIF基因慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG,经酶切及测序后证实目的基因的插入位点和读码框正确;包装病毒感染HASMC,经real-time PCR和Western blot检测证实OIF mRNA和蛋白水平在该细胞株中高表达.结论:成功构建人OIF基因的慢病毒载体,并获得稳定过表达该基因的HASMC.
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p38MAPK信号通路调控人主动脉平滑肌细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达
目的：探讨 p38 MAPK 对人主动脉平滑肌细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达的影响。方法分别使用药理学抑制剂和 siRNA 干预细胞。药理学抑制剂试验细胞分为：①正常对照组，平滑肌细胞完全培养基正常培养；② DMSO （p38 MAPK 抑制剂溶剂）对照组，0．01％ DMSO 处理；③ p38 MAPK 抑制剂组，0．01％ p38 MAPK 抑制剂（20 mg ／mL）处理。基因沉默试验细胞分为：①静态对照组，平滑肌细胞完全培养基正常培养；②阴性对照siRNA组，MACSfectin 试剂转染阴性对照 siRNA 48 h；③ p38 MAPK siRNA 组，MACSfectin 试剂转染 p38 MAPK siRNA 48 h。采用 qRT-PCR 法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原 mRNA 表达；采用 Western blotting 法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达以及 p38 MAPK 转染效率；荧光显微镜观察 siRNA 转染效率。结果与正常对照组相比，DMSO 对照组细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原 mRNA 和蛋白表达无明显变化（P ＞0．05），p38 MAPK 抑制剂组细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原 mRNA和蛋白表达显著降低（P ＜0．05）。与静态对照组相比，阴性对照 siRNA 组细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原 mRNA 和蛋白表达无明显变化（P ＞0．05），p38 MAPK siRNA 组细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原 mRNA 和蛋白表达显著降低（P ＜0．05）。结论p38 MAPK 信号通路调控人主动脉平滑肌细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达。
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同型半胱氨酸通过PI3K/Akt信号通路诱导人主动脉平滑肌细胞增殖
目的 探讨同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)促进人主动脉平滑肌细胞(HASMC)的增殖作用及其分子机制.方法 透射电镜观察HASMC增殖的形态学变化;MTT法测定Hcy对HASMC的增殖作用;Western blot法和荧光定量反转录PCR法分别检测PI3K、p-Akt和Egr-1蛋白及mRNA的表达水平.结果 Hcy处理HASMC 48 h后,细胞内均出现空泡增多、内质网扩张和线粒体固缩的现象,对照组细胞形态正常.随着Hcy浓度的增高,与对照组比较,OD值逐渐增高,当Hcy浓度固定时,48 h OD值较24h升高,差异有统计学意义(P＜0.05).PI3K、p-Akt和Egr-1蛋白相对表达水平随着Hcy浓度的增加而逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.05).PI3K、p-Akt和Egr-1 mRNA表达水平较对照组均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05),且PI3K和Akt mRNA表达水平的增加与Hcy呈浓度依赖性(P＜0.05).结论 Hcy可通过增强PI3 K/Akt信号通路关键蛋白和分子表达,促进早期生长反应因子Egr-1的转录及翻译,诱导人主动脉平滑肌细胞迁移、增生,加速动脉粥样硬化发生.
关键词： 同型半胱氨酸 人主动脉平滑肌细胞 PI3K/Akt信号通路 增殖 -
枸杞多糖对过氧化氢诱导人主动脉平滑肌细胞损伤的保护作用
目的 研究枸杞多糖(LBP)对过氧化氢(H2 O2)诱导的人主动脉平滑肌细胞(HASMC)损伤模型的保护作用.方法 对HASMC进行传代培养,将生长良好的HASMC分为8组,正常对照组加入磷酸盐缓冲液(PBS),药媒对照组给予50 mg·L-1的LBP,模型组给予200 μmol·L-1的H2 O2,洛伐他汀组给予200 μmol·L-1的H2O2 +1 μmol·L-1洛伐他汀,脂必妥组给予200 lμmol·L-1的H2O2+ 50 mg·L-1脂必妥,低剂量LBP组给予200 μmol·L-1的H2O2+25 mg·L-1的LBP,中剂量LBP组给予200 μmol·L-1的H2O2+50 mg·L-1的LBP,高剂量LBP组给予200 μmol·L-1的H2O2+ 100 mg·L-1的LBP.采用3,3 '-[1-(苯胺酸基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯横酸钠法检测细胞增殖,生物化学法检测细胞培养液中丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性,酶联免疫吸附试验检测HASMC上清液中细胞因子水平.结果正常对照组,药媒对照组,模型组,洛伐他汀组,脂必妥组,低、中、高剂量LBP组HASMC活细胞比例分别为84.2％、82.6％、21.3％、52.7％、57.2％、27.4％、42.1％、57.6％,中、高剂量LBP组与模型组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).模型组,洛伐他汀组,脂必妥组,低、中、高剂量LBP组光密度(OD)值、白细胞介素-l(IL-1)、IL-6、组织金属蛋白酶-2(TIMP-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、核转录因子-κB(NF-κB)、MDA、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)水平和SOD活性与正常对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);药媒对照组,洛伐他汀组,脂必妥组,低、中、高剂量LBP组OD值、IL-1、IL-6、TIMP-2、MMP-2、NF-κB、MDA、ICAM-1、VCAM-1水平和SOD活性与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).低、中、高剂量LBP组OD值、IL-1、IL-6、TIMP-2、MMP-2、NF-κB、MDA、ICAM-1、VCAM-1水平和SOD活性与洛伐他汀组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);低、中剂量LBP组以上各指标与脂必妥组比较差异有统计学意义(P＜0.05);不同剂量LBP组之间以上各指标两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论LBP能有效发挥抗炎、抗氧化作用,显著抑制HASMC增殖、迁移,在动脉粥样硬化疾病的治疗方面具有重要价值.
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网膜素改善氧化应激对人动脉血管平滑肌细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的抑制作用
目的 研究网膜素对氧化应激作用下的人主动脉平滑肌细胞胶原Ⅰ、Ⅳ表达的影响.方法 将人主动脉平滑肌细胞系培养,细胞密度到达90％以上后,随机分为5组:对照组、氧化应激组、网膜素组、细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂组和丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂组.其中,对照组不增加任何处理,氧化应激组加入叔丁基氢过氧化物(t-BHP,87.1 μmol/L),网膜素组(87.1 μmol/L t-BHP+ 600 μg/L网膜素)、ERK抑制剂组、p38MAPK抑制剂组为在网膜素组基础上分别加入ERK抑制剂(PD98059,60 μmol/L)和p38MAPK抑制剂(SB203580,100μmol/L),应用Western blot法检测细胞中胶原Ⅰ、Ⅳ表达量.结果 应用MTT法,筛选t-BHP佳作用浓度为87.1μmol/L;与对照组相比,氧化应激组人动脉平滑肌细胞内Ⅰ、Ⅳ型胶原表达显著下降(P＜0.01);与氧化应激组比较,网膜素组Ⅰ、Ⅳ型胶原表达显著升高(P＜0.01);与网膜素组比较,ERK抑制剂组和p38MAPK抑制剂组Ⅰ、Ⅳ型胶原表达均显著下降(P＜0.05).结论 网膜素能改善氧化应激对人动脉平滑肌细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原表达抑制的作用,可能通过此机制促进动脉粥样硬化斑块的稳定,ERK/p38MAPK途径可能参与网膜素的信号传导.
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尿毒症血清诱导的磷酸钙晶体对人主动脉平滑肌细胞的钙化作用
目的 探讨尿毒症患者血清诱导的磷酸钙晶体对人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)钙化的影响.方法 尿毒症患者血清在37℃下孵育3d,超速离心法从尿毒症血清中分离磷酸钙晶体和无晶体血清,采用扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱仪分析晶体的形态及化学特征.体外培养HASMCs,分为以下4组:对照组、尿毒症血清组、磷酸钙晶体组和无晶体血清组.茜素红染色及甲氧酚酞络合酮法检测HASMCs钙化结节的形成及细胞内钙含量.实时荧光定量PCR法检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)、骨桥蛋白(OPN)、核结合因子α1亚基(Cbfα1)、碱性磷酸酶(ALP)、基质γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)的mRNA表达.Cbfα1、OPN和BMP-2的蛋白表达用Westcrn印迹和ELISA法检测.结果 尿毒症血清可诱导磷酸钙晶体形成.与对照组相比,尿毒症血清明显促进HASMCs钙化结节形成,增加细胞内钙含量(P＜0.05),并上调细胞BMP-2、OPN、Cbfα1的mRNA和蛋白表达(均P＜ 0.01)；而磷酸钙晶体亦促进HASMCs钙化结节的形成,增加细胞内钙含量(P＜0.05),上调BMP-2、OPN、Cbfα1的mRNA和蛋白表达(均P＜0.01).无晶体血清组的HASMCs胞内钙含量和上述成骨蛋白的表达与对照组差异无统计学意义(均P＞ 0.05).结论 尿毒症血清可能通过诱导磷酸钙晶体的形成促进血管钙化的发生.
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胃促生长素对人主动脉平滑肌细胞增殖及线粒体融合蛋白2表达的影响
目的 通过体外培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs),研究胃促生长素(ghrelin)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及线粒体融合蛋白2(Mfn-2)表达的影响.方法 体外培养HASMCs,第4～6代细胞用于试验.给予不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)的ghrelin 或10-6 mol/L ghrelin不同时间(0、6、12、18、24 h)处理,用四甲基偶氮唑蓝比色(MMT)法观察其对HASMC增殖的影响.RT-PCR,Western blot方法检测不同处理方法对Mfn-2表达的影响.结果 10-7～10-5 mol/L的ghrelin可明显抑制HASMC增殖,浓度为10-6 mol/L抑制作用为明显(P<0.01).ghrelin在6～24 h内均能明显抑制HASMC增殖,在24 h达高峰(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin能明显上调Mfn-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin在18 h上调Mfn-2 mRNA和蛋白表达的作用为明显(P<0.01).结论 ghrelin可能通过上调Mfn-2的表达来抑制HASMC增殖.
