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肺炎球菌PsaA抗原及其在结合疫苗中的应用
目的 应用基因工程技术表达和制备肺炎链球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A,PsaA),并与细菌荚膜多糖耦联制备成多糖蛋白结合疫苗,探讨PsaA作为肺炎球菌蛋白载体在增强结合疫苗中其他细菌多糖抗原的免疫原性的同时,还能获得对肺炎球菌的抗体反应,从而达到用一种结合疫苗能诱导出针对两种细菌的抗体免疫应答的目的 .方法 从肺炎链球菌基因组中扩增psaA基因,将目的 基因插入原核表达载体pET-28a,获得重组质粒pET28a-psaA,通过转化进入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,采用DEAE-阴离子交换层析法纯化基因重组rPsaA蛋白.将纯化到的rPsaA蛋白与A群脑膜炎荚膜多糖(group A meningococcal polysaccharide,GAMP)耦联成多糖蛋白结合疫苗后,用小鼠动物模型进行免疫实验,检测该疫苗的免疫原性,用ELISA法测定该疫苗在小鼠体内产生的针对肺炎球菌和脑膜炎球菌两种病原菌特异性抗原的抗体水平.结果 成功克隆基因重组表达质粒,而且表达的PsaA蛋白在载体上的组氨酸标签之前终止表达,不带有组氨酸标签,保证疫苗的安全性.SDS-PAGE技术分析表明:rPsaA蛋白高效表达,约为菌体蛋白的60%,蛋白质相对分子质量约为37×103,而且蛋白的可溶性好,不形成包涵体,用DEAE-阴离子交换层析法纯化其纯度可达80%以上.纯化到的PsaA蛋白与荚膜多糖耦联成功,应用于小鼠免疫实验,PsaA蛋白载体能显著增强A群脑膜炎荚膜多糖抗原的免疫原性,并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的特异性抗体.结论 利用基因工程技术获得无组氨酸标签的PsaA蛋白,并将它与A群脑膜炎荚膜多糖耦联,可以在增强荚膜多糖抗原免疫原性的同时,提高疫苗的免疫保护效果,探讨了给儿童接种一种疫苗能同时预防肺炎和脑膜炎两种传染病的可能性.
关键词： 肺炎链球菌表面黏附素A A群脑膜炎荚膜多糖 多糖蛋白结合疫苗 两价疫苗 -
肺炎链球菌内肽酶O及表面黏附素A联合蛋白疫苗免疫保护作用研究
目的 原核表达肺炎链球菌内肽酶O(PepO)及肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA),评价其作为疫苗候选蛋白的免疫保护效果.方法 设计pepO,psaA目的基因片段的特异性引物,经PCR扩增,构建重组质粒pET28a(+)-pepO,pET28a(+)-psaA,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达,经纯化后获得高纯度目的蛋白PepO及PsaA.经黏膜免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗血清,ELISA检测抗体效价,Western blot分析验证目的蛋白抗血清的特异性.将BALB/c小鼠随机分为阴性对照组、PepO组、PsaA组及PepO+PsaA联合免疫组,每组18只.构建不同血清型肺炎链球菌感染模型,评估目的蛋白单用及联合使用的免疫保护效果.结果 成功制备并获得目的蛋白PepO及PsaA,经Western blot验证目的蛋白抗血清特异性好.PepO组和联合免疫组小鼠唾液中IgA及血清中IgG效价比较差异无统计学意义(P>0.05),但均高于PsaA组(P<0.05).PepO组、PsaA组及联合免疫组对鼻腔感染肺炎链球菌D39及CMCC31436小鼠的保护率高于阴性对照组(P<0.05),且PepO组及联合免疫组对鼻腔感染肺炎链球菌D39小鼠的保护率高于PsaA组(P<0.05).抗定植实验结果显示,与对照组比较,PepO组、PsaA组及联合免疫组均能有效降低肺炎链球菌CMCC31693及CMCC31207在小鼠鼻咽部和肺部的定植(P<0.05),且联合免疫组对降低肺炎链球菌CMCC31207在小鼠肺部的定植效果更好(P<0.05).结论 PepO+PsaA联合疫苗经黏膜途径免疫小鼠后,较单用对小鼠有更好的保护作用,能有效抵抗肺炎链球菌在鼻咽部、肺部的定植,是一组较有开发潜力的蛋白疫苗.
关键词： 肺炎链球菌蛋白疫苗 肺炎链球菌内肽酶O 肺炎链球菌表面黏附素A 黏膜免疫 小鼠 -
肺炎链球菌毒力蛋白DNA疫苗优势抗原组合筛选及鉴定
目的 探讨肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原联合免疫的优势抗原组合方式.方法 分子克隆肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)N端及肺炎链球菌溶血素(Ply)基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1-PspA'和pcDNA3.1-PBD(PBD为Ply 点突变减毒体),免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达(包括前期工作中构建的重组质粒pcDNA3.1-PsaA).将3种重组基因疫苗以不同方式组合肌肉注射免疫150只BALB/c小鼠(B组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA',C组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PBD,D组:pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD,E组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA'+pcDNA3.1-PBD),检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39携带改变和D39腹腔攻击小鼠21 d生存情况.结果 成功构建3种重组真核表达载体,ELISA检测结果显示B组小鼠血清特异性IgG抗体水平与E组相似(P>0.05),均明显高于A、C、D组[A组:对照空质粒组pcDNA3.1(+)]小鼠(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部D39携带菌落计数提示B组小鼠相似于E组小鼠(P>0.05),并明显少于C、D组和阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01),并且D39腹腔攻击小鼠21 d生存时间分析亦提示其中位生存时间明显长于C组及阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01).结论 PspA'联合PsaA的抗原组合方式具有高效的协同保护效能,可作为肺炎链球菌DNA疫苗的优势候选抗原组合.
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肺炎链球菌黏附素A基因疫苗的构建及对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用
目的 探讨肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)基因疫苗的免疫原性及其对小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带的防御作用.方法 PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增PsaA基因,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-PsaA,脂质体法转染BHK-21细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(Western blot)检测重组质粒在BHK-21细胞中的转录和表达.应用PsaA基因疫苗肌肉注射免疫BABL/c小鼠,ELISA检测脾细胞上清IFN-γ分泌,特异性抗体IgG水平及其亚型分布(IgG1/IgG2a).利用BABL/c小鼠肺炎链球菌D39株鼻咽部携带模型,鼻咽部灌洗液菌落计数观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌携带改变.结果 RT-PCR及Western blot显示重组PsaA蛋白在BHK-21细胞瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清高水平的IFN-γ及特异性IgG抗体(IsG1/IgG2a＜1),小鼠攻击实验证明PsaA基因疫苗免疫组小鼠D39携带菌落计数明显少于对照组(P＜0.01).结论 肺炎链球菌表面毒力蛋白PsaA基因疫苗免疫小鼠激发了抗原特异性的细胞及体液免疫反应,显著减少了小鼠鼻咽部肺炎链球菌的携带,为肺炎链球菌DNA疫苗理想侯选抗原之一.
关键词： 肺炎链球菌 肺炎链球菌表面黏附素A 基因疫苗 -
肺炎链球菌毒力蛋白在侵入性感染中的免疫原性评价
目的 观察肺炎链球菌表而蛋白A(PspA)、肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)及肺炎链球菌溶菌素(Ply)激发自然途径感染肺炎链球菌机体保护性体液免疫应答的情况,评价这三种毒力蛋白作为治疗性肺炎链球菌疫苗候选抗原的免疫原性.方法 采集侵入性肺炎链球菌感染患者(实验组)及同期确诊为侵入性其它细菌感染患者(对照第一组)和同期确诊为非感染性疾病患者(对照第二组)各36例急性期(第0+3天)及恢复期(第21±3天)血清样本,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中肺炎链球菌3种毒力蛋白抗原特异性抗体IgG水平变化.结果 实验组与两组对照组间第(0+3)天血清的3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平无显著性差异(P>0.05).第一组对照组恢复期较急性期血清中3种毒力蛋白特异性抗体水平无显著变化(P>0.05),而实验组恢复期血清3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平明显高于急性期皿清抗体水平8～30倍(P<0.01),其中PspA和Ply蛋白抗原特异性抗体水平升高更明显,血清中针对PspA家族1(PspA-Fam1)特异性抗体水平高于针对PspA家族2(PspA-Fam2)的特异性抗体水平(P<0.01).结论 PsaA,PspA及Ply均为具有免疫原性的肺炎链球菌菌体成分,其中PspA和Ply特异性抗体在人体自然途径的肺炎链球菌感染中发挥更重要的保护性作用,可作为新一代治疗性肺炎链球菌疫苗理想的侯选抗原.
