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凋亡相关基因pnas-2的表达谱分析
为了确定凋亡相关基因pnas-2在正常组织及急性白血病患者组织中的表达谱,应用Northern blot检测了pnas-2在心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、淋巴结、胸腺、白细胞、骨髓和胎肝等组织中的表达,应用实时PCR(real-time PCR)和Northem blot检测了该基因在急性白血病44份初发、9份未缓解、27份缓解、12份复发样本中的表达,并检测了pnas-2在31例恶性肿瘤患者癌组织及正常组织中的表达.结果表明,pnas-2基因除了在胎盘中表达外,在其他检测的组织中均无表达.pnas-2基因在初发,未CR和复发急性白血病患者中的表达显著高于CR和癌肿患者的癌组织及正常组织中的表达.在7例急性白血病患者的自身前后对照中,pnas-2的表达变化与病程演变有关,即初发时高表达,未CR时无明显改变,但在CR时显著下降,复发时表达又上升.结论:pnas-2的高表达在急性白血病中是特异的,可能是一种癌基因,并很可能参与了白血病的发病.
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抑制凋亡相关基因PNAS-2表达后 U937细胞凋亡率的改变
目的:构建并鉴定凋亡相关基因--PNAS-2的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体,将其转染U937细胞,筛选后检测细胞凋亡的变化.方法:shRNA质粒载体pRNAT U6.1/NEO经限制性内切酶BamH Ⅰ及HindⅢ双酶切后,连接带有BamH Ⅰ及HindⅢ黏性末端的shRNA插入片段,转化感受态细菌,并行测序鉴定.将阳性shRNA质粒载体进行细胞转染,合并使用G418及流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,应用半定量PCR鉴定shRNA封闭效果;用Annexin V-APC/7-AAD标记后,使用FCM及激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡.结果:测序鉴定证实,PNAS-2特异的shRNA质粒表达载体构建正确;合并使用G418及FCM分选出GFP阳性细胞后,半定量PCR鉴定示shRNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组对PNAS-2的抑制率分别为78.1%、75.4%及514%.FCM显示shRNA对照组的细胞凋亡率为(3.52±1.25)%;而shRNA Ⅰ组为(9.23±1.88)%(P＜0.01);shRNAⅡ(8.85±1.80)%(P＜0.05);shRNAⅢ组为(7.19±2.09)%(P＞0.05).激光共聚焦显微镜观察显示,shRNA对照组细胞凋亡率为7.3%;shRNA Ⅰ组为14.7%;shRNAⅡ为13.8%;shRNAⅢ为10.3%.结论:测序结果表明,本研究成功构建了PNAS-2的shRNA质粒表达载体.半定量PCR显示shRNA抑制PNAS-2表达效果佳;抑制PNAS-2后可促使细胞凋亡,提示该基因是抗细胞凋亡基因.
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利用基因芯片分析RNA干扰PNAS-2后凋亡相关基因表达的变化
目的:采用基因芯片技术,比较RNA干扰法封闭U937细胞中PNAS-2基因前后,与凋亡有关基因的变化情况,从而了解PNAS-2在凋亡通路中的可能定位.方法:将急性单核细胞白血病细胞株U937分别转染已构建的靶向封闭PNAS-2的干扰质粒组和对照质粒组,合并使用流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,并运用半定量PCR及实时PCR方法验证RNAi效果.采用affymetrix u133A 2.0基因芯片技术比较2组细胞间基因表达的差异.进一步通过半定量RT-PCR对其中的2条上调基因(IER3、CCL2)和6条下调基因(CASP8、CD74、VEGF、DNASE2、PRTN3、TERT)的表达情况进行验证.结果:半定量及实时PCR检测结果表明,合并使用G418及FCM筛选后得到的转染细胞在90%以上,干扰质粒组对PNAS-2的抑制率达到70%以上;基因芯片筛选结果提示共有1 651条出现上调,1 404条出现下调.其中比值≥2倍的基因共有336条,上调114条,下调222条.根据功能分类初步筛选出与凋亡相关基因共22条,上调基因11条,下调基因11条.RT-PCR检测证实基因芯片结果可靠.结论:抑制PNAS-2表达后促进U937细胞凋亡的机制可能与c-Jun过表达、JNK通路的激活及VEGF基因下调有关.
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抗PNAS-2单链抗体对白血病U937细胞凋亡的影响
目的 观察抗PNAS-2单链抗体与PNAS-2抗原特异性结合的能力,并在此基础上探究其对急性单核细胞白血病U937细胞凋亡的影响.方法 运用反转录病毒转染法将抗PNAS-2单链抗体表达载体pMIG-PNAS-2ScFv转入U937细胞(pMIG-PNAS-2ScFv组),同时设转染pMIG空载体(NC组)及未转染载体的U937细胞(U937组)为对照.流式细胞仪检测转染效率;激光共聚焦显微镜观察单链抗体表达情况及与靶抗原特异性结合的能力;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡;Western blotting观察PNAS-2表达及促凋亡因子caspase-3激活情况.结果 成功将抗PNAS-2单链抗体编码序列转入U937细胞,所表达的单链抗体能与PNAS-2抗原特异性结合.与NC组和U937组相比,pMIG-PNAS-2ScFv组细胞凋亡率明显上升(P<0.05),活化型caspase-3表达增加,但PNAS-2含量并无变化.结论 抗PNAS-2单链抗体能有效结合U937细胞内的PNAS-2抗原并有促进U937细胞凋亡的作用,其促凋亡机制可能与PNAS-2功能位点被封闭后功能失活而无法发挥抑凋亡作用有关.
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磷酸氯喹诱导U937细胞凋亡机制的研究
目的 将磷酸氯喹作用于白血病细胞株U937,观察其对白血病细胞凋亡的影响;并研究磷酸氯喹是否通过逆转凋亡相关基因PNAS-2蛋白在白血病细胞中异常的亚细胞定位,从而促进细胞凋亡的机制.方法 将不同剂量的磷酸氯喹加入体外培养至对数生长期的白血病细胞株U937培养液中.MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡,同时观察磷酸氯喹对U937细胞中PNAS-2蛋白亚细胞定位的影响.结果 50 μg/mL磷酸氯喹可显著促进U937细胞发生凋亡,并使白血病细胞中PNAS-2蛋白的异常亚细胞定位发生改变.结论 磷酸氯喹对白血病细胞株U937有促进凋亡的作用,其凋亡机制可能是使PNAS-2蛋白在白血病细胞中异常的亚细胞定位恢复正常,对于临床治疗白血病的具有潜在的应用价值.
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凋亡相关基因PNAS-2参与硫化砷抗APL细胞的研究
目的探讨凋亡相关基因PNAS-2在硫化砷抗急性早幼粒细胞白血病(APL)中的作用.方法应用基因表达谱芯片检测NB4细胞在10 mg/L硫化砷作用前后的基因表达改变,RT-PCR方法验证基因表达谱芯片结果和检测白血病原代细胞中PNAS-2基因的表达情况.结果10 mg/L硫化砷作用后的NB4细胞中,PNAS-2基因表达特异性下调,且呈时间依赖性,类似变化在K562和U937细胞中未见;10 mg/L硫化砷作用后2例M3患者的原代细胞PNAS-2基因表达明显下调,1例M4患者原代细胞该基因表达未见明显改变.结论PNAS-2基因可能是硫化砷抗APL的靶基因之一.
