miR137-MITF在多发性骨髓瘤预后分析中的作用

目的:探讨miR137的靶基因MITF对多发性骨髓瘤(MM)的预后影响.方法:通过软件预测miR137的靶基因;应用GEP分析MITF是否为多发性骨髓瘤预后因素;构建miR137过表达的MM细胞株;运用实时定量PCR和Western blot法检测MITF在MM细胞株中的表达.结果:软件预测miR137的靶基因有MITF,BUE2H,SH3BP5和KLF12;GEP芯片分析高表达MITF基因的MM患者的预后良好,且在不同亚组中差异比较小.miR137过表达的细胞株中MITF较高.结论:miR137-MITF是判断多发性骨髓瘤预后的重要指标.

耳蜗毛细胞与血管纹的相互依存关系的研究

目的：通过对Atoh1条件基因敲除小鼠及Mitf基因突变小鼠两个动物模型的研究，来验证毛细胞及血管纹两者的存活是否相互依赖，以及在内耳中是否存在钾离子从血管纹-毛细胞-支持细胞-血管纹循环通路。方法分别对一月龄两种模型小鼠进行ABR、CM、CAP和EP的测量。并用免疫组化和共聚焦显微镜以及耳蜗铺片、切片对两种模型小鼠的耳蜗Corti’s器和血管纹进行形态学观察。结果内淋巴的缺损可造成外毛细胞的凋亡，但内毛细胞依然能够存活。20 mV的内淋巴电位是外毛细胞存活所必须的。血管纹的生存及功能并不需要功能正常的Corti’s器的支持，同时内淋巴电位的产生及维持并不依赖毛细胞及支持细胞的钾离子循环的支持。结论成熟毛细胞的存活依赖于正常的血管纹功能和内淋巴的离子环境。然而，血管纹的存活及功能却并不依赖Corti’s器的功能。

MITF基因重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义

目的：通过构建基因MITF及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达，为研究Waardenburg综合征（Waardenburg syndrome，WS）发病机制提供一定的实验依据和基础。方法通过分子克隆技术双酶切pCMV-MITF和pCMV-Flag后连接构建MITF基因重组真核细胞表达质粒pCMV-MITF-Flag，以其为模板分别构建MITF基因新发突变R217I和T192fs表达质粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fs-Flag，DNA测序鉴定。MITF、R217I和T192fs表达质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞或黑色素瘤UACC903细胞，Western blot和细胞免疫荧光分别检测和观察野生MITF蛋白和突变R217I、T192fs蛋白的表达和分布。结果MITF及其突变体R217I和T192fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确，三者在黑色素瘤UACC903细胞中正确表达，MITF和R217I仅在细胞核中分布，而T192fs仅在细胞质分布。结论成功构建了MITF基因及其突变体真核细胞表达质粒，突变对MITF蛋白的亚细胞定位产生影响，为在体外实验进一步研究国人MITF基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。

过表达mitf基因腺相关病毒的构建与鉴定

目的：获得能够过表达小眼畸形相关转录因子(mitf）的重组腺相关病毒载体，用于mitf基因突变相关疾病的基因治疗。方法利用PCR扩增获得目的基因，构建携带目的基因mitf的重组腺相关病毒载体，利用人工脂质体法将pAAV-RC，pHelper ,以及pAAV-GFP系列载体转染到HEK293细胞中，采用细胞内质粒DNA同源重组法进行重组腺相关病毒载体构建，利用柱纯化法纯化病毒载体，qPCR法测定重组腺相关病毒载体滴度，病毒载体感染HEK293细胞进行病毒有效性及安全性鉴定，real-time PCR与western blot法进行mitf表达的鉴定。结果 PCR扩增和测序结果一致证实成功获得目的基因并且成功构建mitf基因腺相关病毒载体，测得高水平病毒滴度1.0*10^12vg/ml，病毒载体感染HEK293细胞转染效率为86.3%，并未发现HEK293细胞死亡，Real-time PCR及Western blot检测构建Mitf基因转录mRNA与表达的蛋白与正常MITF一致。结论成功构建的携带mitf基因的重组腺相关病毒载体为未来进行mitf突变导致的遗传性疾病的基因治疗提供新思路。

Mitf-M基因突变对猪耳蜗血管纹发育的影响

目的 研究Mitf-M基因突变是否会引起血管纹毛细血管、边缘细胞的变化,从而进一步了解Mitf-M基因突变引起Waardenburg综合征的病变机制.方法 取出生后7d、10d、30d、40d的野生型和Mitf-M突变型猪共24头,分离解剖耳蜗外侧壁,运用免疫组织化学技术染色,观察野生型和Mitf-M突变型猪耳蜗血管纹毛细血管、边缘细胞在出生后不同时期的免疫荧光的差异.结果 Mitf-M突变型猪与野生型猪在出生后7d、10d及30d,血管纹毛细血管之间没有明显差异,而在40d,Mitf-M突变型猪相对野生型猪的血管纹毛细血管出现明显的减少,并有统计学意义.在7d、40d,Mitf-M突变型猪耳蜗血管纹边缘细胞的细胞骨架均无明显破坏,边缘细胞数量之间没有明显差异.结论 Mitf-M基因突变不引起血管纹边缘细胞骨架的破坏及边缘细胞数量的减少,且Mitf-M突变型猪在出生后早期30d内血管纹毛细血管没有明显变化,在40d后Mitf-M突变型猪较野生型猪的耳蜗血管纹毛细血管出现明显的减少.

Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) controls melanocyte survival and differentiation through directly regulating the expression of the tyrosinase (TYR) and tyrosinase-related proteins 1 and 2 (TYRP1 and TYRP2) genes. MITF mutations have been reported to result in an abnormal melanocyte devel-opment and lead to Waardenburg syndrome type 2 (WS2), characterized by variable degrees of sensorineu-ral hearing loss and patchy regional distribution of hypopigmentation. Recently, MITF was also indicated as a causative gene for a more severe syndrome, the Tietz Syndrome (TS), characterized by generalized hy-popigmentation and complete hearing loss. However, few functional studies have been performed to com-pare the diseases-causing mutations. Here, we analyzed the in vitro activity of two recent identified WS2-as-sociated mutation (p.R217I and p.T192fsX18) and one TS-associated mutation p.N210K. The R217I MITF retained partial activity, normal DNA-binding ability and nuclear distribution, whereas the T192fsX18 MITF failed to activate TYR promoter due to loss of DNA-binding activity, and aberrant subcellular localization. The aberrant subcellular localization of T192fsX18 MITF may be caused by deletion of a putative nuclear localization signal (NLS) at aa 213-218 (ERRRRF). Indeed, MITF with deletion of the NLS fragment failed to translocate into the nucleus and activated the TYR promoter. Tagging this NLS to GFP promoted the green fluorescence protein (GFP) translocated into the nucleus. The surprising finding of our study is that a TS-as-sociated MITF mutation, N210K, showed comparable in vitro activity as WT. Thus, the possible involve-ment of MITF in TS and its underlying mechanisms still need further investigation.

正常人黑素细胞MITF对酪氨酸酶相关蛋白的转录调控研究

目的 研究正常人黑素细胞小眼畸形相关转录因子(MITF)对与黑素生成密切相关的酪氨酸酶相关蛋白(TRPs)家族的转录调控.方法 应用小RNA干扰技术(慢病毒感染),对培养的原代正常人黑素细胞进行MITF基因沉默,然后应用实时定量PCR和免疫印迹方法,分别检测MITF基因沉默前后,MITF、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)的基因与蛋白表达水平.结果 正常人黑素细胞具有显著表达的MITF、TYR、TYRP1和TYRP2； MITF基因沉默后,MITF、TYR和TYRP1的基因表达水平分别下降2倍(P =0.001)、1.5倍(P=0.05)和5倍(P =0.005),TYRP2的表达水平上调3倍(P =0.004)；而MITF基因沉默后的MITF、TYR、TYRP1的蛋白表达也显著下降,TYRP2蛋白显著升高.结论 黑素细胞TRPs家族与MITF转录调控密切相关,TYRP2可能存在不依赖于MITF的转录调控.

蒺藜皂苷对人黑素瘤A375细胞酪氨酸酶和小眼相关转录因子表达的影响

目的:在前期研究的基础上,以蒺藜皂苷为研究对象,考察其对A375细胞酪氨酸酶活性、TYR和MITF mRNA的表达的影响.方法:采用不同浓度的蒺藜皂苷作用于A375细胞48 h后,应用左旋多巴氧化法测定酪氨酸酶活性,荧光定量PCR法检测A375细胞TYR和MITF mRNA的表达情况.结果:应用蒺藜皂苷处理后,酪氨酸酶活性均有不同程度的增加,当达到100 μg/mL和200 μg/mL时,有统计学差异.TYR和MITFmRNA的表达明显增强(P＜0.05).结论:蒺藜皂苷可能通过增强A375细胞TYR和MITFmRNA的表达,以提高酪氨酸酶活性,促进黑素合成,从而为蒺藜皂苷的开发与应用奠定基础.

芪白合剂对培养的人黑素细胞生长及酪氨酸酶、MITF基因表达的影响

目的 研究芪白合剂对黑素细胞生长及黑素细胞酪氨酸酶、小眼相关转录因子(MITF)基因表达的影响.方法 芪白合剂组方黄芪、党参、白芷、白蒺藜、鸡血藤,水煎煮浓缩成3 g/mL,取青紫蓝兔,按12 mL·kg-1·d-1连续灌胃3天后于末次给药1 h,2 h和5 h无菌采血,收集血清;采用体外培养正常人黑素细胞,观察不同采血时间的芪白合剂含药血清对黑素细胞生长、酪氨酸酶的活性、黑素合成以及用RT-PCR的方法测定其对酪氨酸酶、MITF基因表达的影响.结果 含药血清与对照血清比较,能明显促进黑素细胞生长,上调酪氨酸酶的活性和黑素合成(P＜0.05),以1 h和2 h所采血清作用明显.并可以促进酪氨酸酶和MITF的基因表达.结论 芪白合剂可以通过直接作用于黑素细胞和酪氨酸酶通道来促进黑素合成.

Mitf和Pax6基因在小鼠胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化过程中的表达

目的 探讨Mitf和Pax6基因在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)向视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞分化过程中的表达规律及其作用.方法 免疫荧光染色、流式细胞仪检测分化前mESCs株在不同代数的干性标志表达情况.采用悬浮培养加诱导剂形成拟胚体(embryoid bodies,EBs)的方式诱导mESCs向RPE细胞分化,在分化前第0天,分化后第10、40天,采用流式细胞仪检测Mitf和Pax6在细胞中的表达规律及其与mESCs向RPE细胞分化的关系.结果 mESCs株AB1在持续传代过程中形态一致且其干性标志SSEA1表达比例在不同代数之间差异无统计学意义(P＞0.05).分化所得细胞的RPE细胞成熟标志Bestropih、CRALBP、RPE65的表达比例分别为(61.6±2.4)％、(31.0±3.9)％、(57.8±2.0)％.在分化前第0天,Mitf、Pax6的表达比例分别为(1.7±1.5)％、(6.5±0.2)％,分化第10天分别为(28.5±7.2)％、(60.2±15.6)％,分化第40天分别为(5.7±2.1)％、(4.6±0.6)％.结论 在mESCs向RPE细胞的分化过程中,Mitf和Pax6均呈先上升后下降的趋势,提示Mitf和Pax6参与了RPE细胞的分化过程.

复方中药对小鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶与MITF mRNA表达的调节

目的:探讨复方中药"白癜冲剂"治疗白癜风的分子学作用机制.方法:采用定量逆转录-聚合酶链式反应(QRT-PCR)方法,检测"白癜冲剂"组(实验组)与无中药组(对照组)小鼠B16黑素瘤细胞株酪氨酸酶与MITF mRNA表达量.结果:实验组黑素瘤细胞酪氨酸酶与MITF mRNA表达量比对照组大(P＜0.05).结论:复方中药"白癜冲剂"能上调黑素细胞酪氨酸酶与MITFmRNA表达水平,可能是其治疗白癜风的作用机制之一.