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SCL基因反义寡核苷酸对K562和CEM细胞系的作用
干细胞白血病(SCL)基因是新发现的与白血病发生有关的癌基因.为进一步探讨SCL反义寡核苷酸对白血病细胞的作用,本研究应用SCL基因的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN)分别与K562和CEM白血病细胞系作用,观察细胞生长、分化、凋亡和SCL mRNA变化.结果显示:(1)AS-PS-ODN对K562和CEM细胞的生长有不同程度的抑制作用,并呈量效和时效关系;(2)AS-PS-ODN作用后K562细胞联苯胺染色阳性率明显增加;(3)AS-PS-ODN作用后K562细胞发生凋亡现象,但未观察到CEM细胞凋亡;(4)AS-PS-ODN作用后K562细胞和CEM细胞SCL mRNA表达水平减低,同时CEM细胞SIL-SCL mRNA表达水平也减低.结论:AS-PS-ODN能特异性抑制K562和CEM细胞的增殖,减低SCL mRNA和SIL-SCL mRNA表达水平,同时促进红系分化,诱导K562细胞过早凋亡.
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含人干细胞白血病基因慢病毒载体转染Cajal 样间质细胞的效果研究
目的：观察携带增强绿色荧光蛋白（GFP）的含人干细胞白血病（SCL）基因慢病毒载体转染体外培养的豚鼠膀胱 Cajal 样间质细胞（ICC）的效果。方法2014年10月—2015年8月，选取普通级成年健康豚鼠16只。构建含人 SCL 基因的慢病毒载体，并标定病毒滴度；采用随机数字表法选取健康豚鼠4只，采用颈椎脱臼方法将其杀死，体外培养豚鼠膀胱 ICC。设置不同感染复数（MOI）（0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0），利用含人 SCL 基因的慢病毒载体转染 ICC，在激光共聚焦显微镜下观察 ICC 生长状态并计算转染效率，确定佳 MOI。采用随机数字表法将 ICC 分为正常对照组、空白质粒对照组与慢病毒转染组，其中正常对照组加入1％磷酸盐缓冲液（PBS），空白质粒对照组加入空慢病毒，慢病毒转染组按佳 MOI 加入含人 SCL 基因的慢病毒载体，计算各组转染效率，确定佳转染时间。采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测 SCL mRNA 表达情况。上述实验均独立重复4次。结果经测定，病毒滴度为5×108 TU/ ml。倒置显微镜下发现一些特征性梭形细胞，其两侧有显著外凸分枝，细胞核较大，其外形规则，有序地实现细胞贴壁，而其他未贴壁细胞则呈现与 ICC 不一样的形态，胞体多为椭圆形，细胞两极无突起，整体形状扁平。激光共聚焦显微镜下可以发现酪氨酸蛋白激酶生长因子受体（c-kit）受体成功表达，证实培养的细胞是膀胱 ICC。观察各组 ICC 生长状态，当 MOI 为0.5、1.0、5.0、10.0时，细胞生长状态较好，无细胞死亡，当 MOI为50.0、100.0时，可见部分细胞死亡，细胞活性降低；MOI 为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI为0.5时（P ＜0.05）；MOI 为5.0、10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为1.0时（P ＜0.05）；MOI 为10.0、50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为5.0时（P ＜0.05）；MOI 为50.0、100.0时的转染效率高于 MOI 为10.0时（P＜0.05）；综合 ICC 生长状态及转染效率，确定含人 SCL 基因慢病毒载体转染 ICC 的佳 MOI 为10.0。正常对照组、空白质粒对照组 ICC 中无 GFP 表达；慢病毒转染组转染3 d 时 ICC 中 GFP 表达强度高于转染2 d、转染5 d 时，确定含人 SCL 基因慢病毒载体转染 ICC 的佳转染时间为3 d。慢病毒转染组中扩增产物大小与目的片段大小1036 bp 一致，而正常对照组及空白质粒对照组均未见特异性条带表达，表明 SCL 基因成功导入 ICC。结论利用含人 SCL 基因慢病毒载体能高效转染体外培养的 ICC，并成功介导 SCL 基因在 ICC 中的表达，为下一步研究利用 SCL 基因进行体内转染实验奠定基础。
关键词： 转染 干细胞白血病基因 慢病毒载体 Cajal样间质细胞 -
AdMax系统构建腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal样间质细胞及其表达
目的 构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的转染及其介导SCL基因的表达.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率,RT-PCR法分析转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA的表达.结果 PCR结果和Western blot法检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/ml,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率高达98%,RT-PCR法检测转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA有表达.结论 成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal样间质细胞的表达.
关键词： 干细胞白血病基因 腺病毒载体 转染 Cajal样间质细胞 -
经尿道灌注SCL基因重组慢病毒的DCP豚鼠膀胱Cajal样间质细胞数量、分布及超微结构观察
目的 观察经尿道灌注干细胞白血病(SCL)基因重组慢病毒的糖尿病膀胱病(DCP)豚鼠膀胱Cajal样间质细胞(ICC)的数量、分布及超微结构变化.方法 构建SCL基因重组慢病毒且标定滴度.选择雄性豚鼠70只,单次腹腔注射链尿佐菌素12周后构建DCP豚鼠模型,将成功造模的27只豚鼠随机分为实验组、阳性对照组、空白对照组,每组9只.实验组、阳性对照组、空白对照组豚鼠分别经尿道灌注(转染)SCL基因重组慢病毒、空慢病毒和等量PBS液.分别于转染后7、14、28 d每组各处死3只豚鼠,取膀胱组织,制作切片,激光共聚焦显微镜下观察GFP表达、膀胱ICC数量及分布变化,透射电镜下观察膀胱ICC的超微结构变化.结果 实验组随转染时间延长,ICC数量逐渐增多(P均<0.01),分布越发密集,但绿色荧光逐渐减退;空白组和对照组未见绿色荧光,随转染时间延长,ICC数量逐渐减少(P均<0.05),分布稀疏;转染14、28 d时,实验组ICC数量较空白组和对照组增加(P均<0.01).实验组随转染时间延长,ICC细胞器数量增多,形态趋于正常,细胞内空泡减少,胞周突起延长变多,ICC超微结构处于不断恢复之中;而阳性对照组和空白对照组ICC超微结构病理变化逐渐加重.结论 经尿道灌注SCL基因重组慢病毒转染DCP豚鼠膀胱后,膀胱ICC数量增多,分布更加密集,细胞超微结构得到修复,提示SCL基因对DCP可能有一定治疗效果.
关键词： 干细胞白血病基因 Cajal样间质细胞 糖尿病膀胱病 -
含人干细胞白血病基因的重组慢病毒表达载体的构建及鉴定
目的：构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒表达载体（GV287-SCL），为糖尿病膀胱异常病症（ DCP）的基因治疗奠定基础。方法采用PCR法将人SCL基因质粒内的遗传物质扩增，与慢性病毒穿透质粒结合，构建重组穿梭质粒GV287-EGFP／SCL，共转染293T 细胞，通过多次感染、扩增和提纯，得到重组慢病毒GV287-SCL。以不同浓度重组慢病毒原液感染293 T细胞，采用Western blotting法检测目的基因，荧光标记法计算病毒滴度。结果人SCL基因扩增产物大小为1036 bp，与目的基因相关片段中SCL cDNA大小相同。阳性转化子扩展后均形成503 bp条带，其大小与目的片段人SCL cDNA相当。重组质粒GV287-EGFP／SCL阳性克隆的目的基因SCL成功插入到GV287-EGFP，基因排序和GenBank信息库里的人SCL基因mRNA基本相同。重组慢病毒滴度为5×108 TU／mL。结论成功构建了GV287-SCL，病毒滴度为5×108 TU／mL。本研究为继续进行SCL基因体内转染及开展DCP的基因治疗提供了基础。
关键词： 糖尿病膀胱异常病症 干细胞白血病基因 慢病毒载体 转染 Cajal样间质细胞 -
经尿道灌注干细胞白血病重组基因慢病毒对糖尿病膀胱病变豚鼠膀胱功能的影响
目的 探讨经尿道灌注干细胞白血病重组(SCL)基因慢病毒对糖尿病膀胱病变(DCP)豚鼠膀胱功能的改善作用.方法 采用单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)法建立豚鼠糖尿病模型,培养12周后建立DCP模型.选取DCP豚鼠20只,随机分为模型组、SCL组各10只.取未造模的10只作为对照组.各组麻醉后经尿道插入自制尿管,排空尿液,对照组和模型组均经尿管灌注PBS液0.2 mL,SCL组经尿管灌注佳感染复数(MOI)的SCL基因慢病毒0.2 mL(2×107 IU).灌注后结扎尿管,保留膀胱灌注液2 h.灌注后28 d时用代谢笼收集三组24 h尿量;行尿动力学检测,于膀胱排尿后即刻测残余尿量、大膀胱容量、排尿期大逼尿肌压、单次排尿周期灌注量、膀胱顺应性.切除完整膀胱,排尽尿液后称量膀胱湿重.结果 与对照组相比,模型组和SCL组24 h尿量、膀胱湿重、大膀胱容量、残余尿量均增加,大逼尿肌压、膀胱顺应性均降低(P均<0.05);与模型组相比,SCL组24 h尿量、膀胱湿重、大膀胱容量、残余尿量均降低,大逼尿肌压、膀胱顺应性均增加(P均<0.05).结论 经尿道灌注SCL慢病毒能够显著改善DCP豚鼠的膀胱功能,为治疗DCP提供了新的途径与方法.
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人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达
目的 构建含人干细胞白血病(SCL)基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞(ICC),为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础.方法 通过聚合酶链反应(PCR)将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度.体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数(MOI)值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定佳MOI值.重组慢病毒载体以佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC(空载体组)及未转染的ICC(空白组)作为对照,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SCL基因在ICC中的表达.结果 经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光.MOI为10时转染效果佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组.结论 成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达.
关键词： 干细胞白血病基因 慢病毒载体 转染 Cajal样间质细胞 -
腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal间质细胞及其表达
目的 构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对Cajal间质细胞的转染及其介导的SCL基因的表达.为下一步在体转染Cajal间质细胞,观察其对Cajal间质细胞表型逆转的影响奠定基础.方法 利用Ad-Easy系统、细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒Ad-GFP/SCL.通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对培养的Cajal间质细胞的转染效率.通过RT-PCR法分析转染Cajal间质细胞后SCL mRNA的表达.结果 酶切鉴定及PCR结果证明成功构建了含有人SCL基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.6×1011 pfu/ml;对Cajal间质细胞的转染率高达100%;RT-PCR法检测转染Cajal间质细胞后SCL mRNA有表达.结论 成功构建的含人SCL基因的重组腺病毒对Cajal间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal间质细胞中表达.
