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5-氮杂-2’-脱氧胞苷和4-苯基丁酸对慢性粒细胞白血病细胞的miR-196b表达水平有协同作用
目的：探讨慢性粒细胞白血病细胞中影响miR-196b表达水平的表观遗传学因素。方法分别采用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-dc）、组蛋白去乙酰化酶抑制剂4-苯基丁酸（ PBA）和两者联合处理K562细胞，采用实时定量PCR（Real-time PCR）检测miR-196b的表达水平变化。结果 PBA的半数抑制浓度为1．58mmol/L。和正常人骨髓细胞miR-196b的表达水平相比，Aza组、PBA组和阴性对照组miR-196b的表达水平显著降低且基本一致，Aza＋PBA组miR-196b的表达水平和正常人表达水平基本一致。结论单独使用5-Aza-2’-dc或PBA不能使K562细胞中miR-196b的表达恢复正常，两者联合使用共同处理K562细胞，可使miR-196b的表达恢复正常，表明K562细胞中miR-196b的表达水平和基因组甲基化及组蛋白乙酰化均有关系。
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miR-196b海绵吸附慢病毒载体的构建及其在骨髓基质细胞系ST2中的表达
目的 构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础.方法 根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC 19质粒中,再经酶切连接至pLVX-shRNA2慢病毒载体,利用293T细胞将构建成功的miR-196b海绵吸附慢病毒载体进行病毒包装和滴度测定,pLVX-shRNA2慢病毒作为对照组,miR-196b海绵吸附慢病毒作为实验组,将其感染ST2细胞,观察感染效率,并通过Western blotting检测miR-196b靶基因叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白水平.结果 酶切鉴定和测序结果正确,慢病毒包装所测滴度为1×108 PFU/mL,将其感染靶细胞,其感染效率达80％.Western blotting结果显示,与对照组相比,其靶基因FoxO1蛋白表达水平有明显增加(P＜0.05).结论 成功构建了miR-196b海绵吸附慢病毒载体,并能有效吸附内源性的miR-196b,从而发挥其抑制作用.
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非小细胞肺癌中miR-196a/b的表达及临床意义
目的 分析miR-196a和miR-196b在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义.方法 收集非小细胞肺癌手术标本157例及癌旁组织标本50例,提取总RNA,采用Realtime PCR方法检测miR-196a和miR-196b在非小细胞肺癌及其癌旁组织中的表达,分析二者表达的相关性,并分析其表达与临床病理特征及其预后的关系.结果 miR-196a和miR-196b在非小细胞肺癌组织中的表达高于癌旁肺组织,二者表达呈正相关(r=0.457,P＜0.001).miR-196a和miR-196b联合高表达与组织类型(P=0.010)、淋巴结有无转移(P=0.016)、远处转移(P=0.007)及临床分期(P=0.007)相关,而与年龄、性别、组织分化程度无显著相关性(P＞0.05).Kaplan-Meier生存分析显示miR-196a和rniR-196b联合高表达组患者生存期显著低于联合低表达或者单独高表达组(p＜ 0.001),Cox风险比例模型分析显示miR-196a和miR-196b联合高表达为非小细胞肺癌患者独立的危险因素.结论 miR-196a和miR-196b在非小细胞肺癌中异常高表达可能是潜在的肺癌预后分子标志物.
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儿童急性髓系白血病中miR-196b表达及预后意义
目的：通过检测miR-196b在初诊急性髓系白血病(AML)患儿中的表达，评估miR-196b在儿童AML中的临床意义。方法从标本库中抽取52例初诊AML患儿骨髓，利用qRT-PCR方法检测miR-196b表达水平(结果以2-??Ct表示)，并与同期30例非白血病患儿标本对照。结果单核系组(M4、M5)的miR-196b表达水平高于非单核系组(M1、M2、M3、M6、M7)和对照组，而非单核系组低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)。miR-196b表达水平在t(15；17)组低，11q23(MLL)组高，差异有统计学意义(P<0.01)。使用NCCN2013预后分组标准，预后良好组miR-196b表达低于预后不良组，差异有统计学意义(P<0.01)。首疗程缓解组miR-196b表达明显低于首疗程未缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)。WBC≥100×109/L组miR-196b表达水平高于WBC<100×109/L组，差异有统计学意义(P<0.01)。miR-196b表达水平与初诊时血小板计数呈显著正相关(r=0.302，P=0.030)。结论 miR-196b表达水平在初诊AML预后不良组明显增高，高水平的miR-196b与低缓解率和较差的预后相关。miR-196b有望成为AML患儿治疗新靶点。
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MicroRNA在晚期大肠癌一线化疗疗效中的预测作用
背景与目的：大肠癌是一种高发病率的恶性肿瘤，化疗可以减少肿瘤的生长和复发。当前较为重要的是探究标志物能够预测化疗耐药标志物，从而帮助确定治疗方案。方法：选取2007年11月-2010年5月复旦大学附属肿瘤医院大肠外科Ⅳ期大肠癌患者手术标本，术后患者都使用大肠癌术后规范化一线化疗(希罗达+奥沙利铂)。选取化疗耐药与有效癌组织标本各3例共6例使用microRNA芯片检测。筛选出有统计学意义的miRNA：miR-4299、miR-196b、miR-324-5p、miR-455-3p和miR-939，将候选miRNA在100例Ⅳ期大肠癌患者手术癌组织标本中进行real-time PCR验证。结果：通过芯片筛选，共5个miRNA可能与大肠癌一线化疗耐药有关。miR-4299和miR-196b对化疗耐药有显著诊断意义。miR-4299的AUC为0.784，而miR-196b的AUC为0.647。两个联合诊断AUC为0.848，敏感度和特异度分别为67.9%和90.9%。结论：miR-4299和miR-196b有可能作为诊断对大肠癌一线化疗耐药的标志物。
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miR-196b、miR-25在儿童急性髓细胞白血病中的表达及临床意义
目的 探讨初诊AML患儿miR-196b、miR-25的表达及其临床意义.方法 从骨髓标本库中随机抽取2012-2013年收集的20例初诊AML以及20例非白血病对照标本,利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-196b、miR-25的相对表达量.结果 miR-196b的相对表达量在患者和对照组间有显著差异(P＜0.05);在危险度分组中,miR-196b在高危组、中危组和低危组有显著差异(P＜0.05);在WBC＜ 10万/mm3和≥10万/mm3组间,miR-196b表达有显著差异(P＜0.05);在一疗程缓解组/未缓解组,miR-25表达有显著差异(P＜0.05);在染色体核型预后良好组/预后不良组间,miR-196b表达水平具有显著差异(P＜0.05),核型不良组miR-196b表达水平增高;而miR-25呈低表达现象,差异有显著统计学意义(P＜0.05).结论 miR-196b在初诊AML患儿中明显高表达,高表达的miR-196b与不良预后相关;miR-25的表达水平增高提示着良好的早期治疗反应和预后.这些miRNAs有望成为儿童AML早期诊断、治疗及判断预后的独特生物标记物.
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肾脏特异性microRNA的鉴定及功能预测
目的:应用Solexa技术分析和筛选出肾脏特异性表达microRNA (miRNA),同时利用生物信息学技术预测特异表达miRNA的靶基因并对其功能进行初步分析,探讨特异表达miRNA在肾脏中的功能. 方法:选取8周龄C57/B6雄性小鼠,取其全身11个组织器官,提取总RNA并从中分离小分子量RNA进行Solexa测序,筛选出相较其他组织器官,在肾脏中表达为特异的miRNA;然后,利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术对筛选出的肾脏特异性表达miRNA进一步验证;后,通过生物信息学技术对其进行靶基因预测,并对交集的基因集合分别进行GO分析和KEGG通路分析. 结果:Solexa测序结果显示在正常小鼠中miR-196a和miR-196b在肾脏特异性高表达.qRT-PCR验证了miR-196a和miR-196b在小鼠11个组织器官中的表达分布情况,定量结果与测序结果相一致.TargetScan6.2和PicTar两个软件预测到交集靶基因74个.GO分析显示miR-196a/b的预测靶基因集合显著富集在血小板源生长因子结合活性、转录调控活性、细胞外基质的结构组成等分子功能上并参与调控代谢、发育等生物学过程(P＜0.01).信号转导通路显著富集于促性腺激素释放激素信号通路、细胞外基质受体相互作用等多个信号通路和脑胶质瘤、前列腺癌等疾病通路中(P＜0.05). 结论:miR-196a/b在肾脏中特异性高表达,靶基因功能广泛,与细胞代谢、生长发育等密切相关.
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红系细胞发育相关miR-196b的靶基因预测及意义
目的 预测红系细胞发育相关miR-196b的靶基因,并探讨其作用机制.方法 应用miRbase数据库查找多物种已知的miR-196b成熟序列,比对后分析其在多物种间的保守性.应用miRanda、miRDB、Targetscan7.1、PITA和miRWalk数据库对miR-196b的靶基因进行预测,筛选重复率较高的靶基因.应用Cytoscape3.3.0和KEGG对重复率较高的靶基因进行GO分类富集分析和信号通路富集分析.查阅文献,再次筛选与红系细胞发育相关的靶基因,采用Targetscan7.1和RNA22分析其与miR-196b的结合情况.结果 22个物种具有miR-196b成熟序列,序列比对发现miR-196b在多物种间高度保守.靶基因预测结果显示,共得到5 004个miR-196b的靶基因,其中重复率较高的靶基因有302个.GO分类富集分析结果显示,miR-196b靶基因在生物学过程显著富集于发育过程、细胞过程和定位等,在分子功能显著富集于蛋白结合和物质转运等,在细胞组分显著富集于细胞突起和细胞器膜等(P均＜0.05).结合信号通路富集分析结果,筛选出43个与红系细胞发育相关miR-196b的靶基因,其信号通路富集于Ras信号通路、cAMP信号通路和PI3K-Akt信号通路等(P均＜0.05).结合文献,终筛选出与红系细胞发育相关的miR-196b靶基因有5个,分别为GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2,其中GATA1、Cdkn1b和Cdh1可与miR-196b直接结合.结论 红系细胞发育相关miR-196b的靶基因可能为GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2;miR-196b可能通过对上述靶基因的直接或间接作用激活相应信号通路,在红系细胞的发育过程中发挥生物学作用.
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miR-196b和HoxB8在结直肠癌组织中的表达及其临床意义
目的 探讨结直肠癌组织中miR-196b和HoxB8的表达及临床意义.方法 选取2012年10月-2014年3月在该院手术治疗的47例结直肠癌患者为研究对象,术中留取结直肠癌组织及正常黏膜组织,应用实时荧光定量PCR技术检测二者miR-196b mRNA和HoxB8 mRNA表达情况,HoxB8蛋白表达检测应用Western blot,对检测结果进行统计学分析.结果 结直肠癌组织中miR-196b mRNA和HoxB8 mRNA表达量显著高于正常黏膜组织(P＜0.01),且结直肠癌中两者表达水平呈显著负相关(r =-0.462,P=0.012);miR-196b表达与肿瘤分期及淋巴结转移相关(P＜0.05),而HoxB8表达与结直肠癌临床病理特征不具有相关性(P ＞0.05).结论 结直肠癌组织中miR-196b及HoxB8表达水平显著升高,miR-196b不仅参与结直肠癌的发生发展,而且可能抑制HoxB8表达.
关键词： 结直肠癌 miR-196b HOXB8 PCR Western blot
