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葡萄糖调节蛋白75对缺糖诱导的凋亡相关基因Bax和NF-κB改变的影响
目的 通过已获得稳定表达葡萄糖调节蛋白(Grp75)的PC12细胞株,检测Grp75对缺糖诱导的细胞凋亡过程中Bax和NF-κB的影响. 方法 Grp75过表达组和对照组细胞无糖培养6h、12h、24h和48h后,进行相关的实验.免疫印迹法检测缺糖状态下两组细胞中Grp75的表达水平和NF-κB的活性;应用半定量RT-PCR和免疫印迹法比较Bax表达水平的变化;免疫细胞化学通过构象特异性的Bax 6A7抗体检测Bax的活化. 结果 Bax活化和 NF-κB活性的下降在缺糖诱导的PC12细胞凋亡过程中发挥了重要的作用.而Grp75通过阻止Bax的活化和NF-κB活性的下降抑制缺糖诱导的凋亡.缺糖状态下Grp75过表达组和对照组细胞中Bax表达水平均未发生改变. 结论 Bax活化和NF-κB活性下降与缺糖诱导的PC12细胞凋亡关系密切,Grp75通过阻止Bax的活化和维持NF-κB的活性保护PC12细胞.
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GRP75功能及与肿瘤关系的研究进展
GRP75在细胞中参与多个细胞信号途径调节细胞应激反应、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡.近年来,GRP75在多种肿瘤组织中高表达,并且与多种肿瘤的发生及转移等都有着密切的关联.因此,对GRP75功能的研究可为肿瘤的治疗提供了新的靶点.现就GRP75蛋白的相关功能及与肿瘤之间关系的研究现状展开综述.
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大鼠急性心肌梗死后缺血缺氧心肌早期凋亡信号分子的变化
目的 探索能够应用于临床辨别早期缺血心肌生物学活性的敏感代谢变化指标.方法 SD大鼠行冠状动脉前降支结扎术建立心肌缺血模型,分别结扎0(对照组)、5、20、45 min.采用luciferin/luciferase法,RT-PCR法和免疫组织化学法分析心肌组织在不同缺血时间段梗死区、梗死边缘区及正常区ATP含量变化,葡萄糖调节蛋白75(grp75)和缺氧诱导因子1α(HIF1α)基因表达变化,以及细胞色素C释放、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)降解的情况.结果 大鼠冠状动脉前降支分别结扎5、20、45 min时,梗死区及梗死区边缘心ATP含量上升,并于20、45 min时明显高于正常水平;grp75及HIF1α基因转录水平未见明显改变.免疫组化结果显示少数细胞细胞色素C的释放出现于冠状动脉前降支结扎5 min,而PARP的降解发生较迟,出现于冠状动脉前降支结扎20 min.冠状动脉前降支结扎45 min时细胞色素C的释放和PARP的降解明显增强免疫反应呈现片状染色.结论 大鼠急性心肌缺血后早期梗死区发生细胞凋亡,细胞色素C释放、PARP降解出现较早,可用作为临床辨别缺血心肌生物学活性的早期变化指标.
关键词： 心肌缺血 葡萄糖调节蛋白75 缺氧诱导因子1 细胞色素C 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 -
葡萄糖调节蛋白75的表达特性
目的研究不同条件下葡萄糖调节蛋白75基因的表达情况.方法用多组织尼龙膜(multiple tissuenylon,MTN)Northern杂交显示grp75在组织中的表达情况,用Northern杂交方法研究其在缺糖、氧化磷酸化阻滞剂叠氮钠、Ca2+增强剂A23187处理后的表达情况.结果grp75在多组织中都有表达,且表达量大致相同,在缺糖培养的情况下,细胞的grp75基因明显呈上调表达.高浓度的叠氮钠能够使grp75基因表达大幅度上调,A23187使grp75的表达量增加.结论grp75基因在细胞中有构成性表达,能够在多种组织的细胞中发挥作用,grp75基因的表达量和细胞自身的能量代谢有关,为grp75基因对细胞缺糖保护提供了证据;在grp75表达与调控过程中,Ca2+发挥着很重要的作用.
关键词： 葡萄糖调节蛋白75 Northern杂交 钙离子 -
谷氨酰胺对细胞缺糖损伤的保护作用
目的观察谷氨酰胺(glutamine,Gln)对细胞缺糖(glucose desprivation,GD)损伤的保护作用,并探讨可能的作用机制.方法在以无糖培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞建立细胞缺糖损伤模型的基础上,首先以噻唑蓝比色(MTT)法、流式细胞法、细胞线粒体跨膜电位检测等方法观察Gln对缺糖损伤细胞模型的作用;再以大鼠大脑中动脉线栓法建立动物脑缺血模型,观察Gln对动物缺血性损伤的保护作用;同时用免疫细胞化学法、Western blot印迹法检测细胞中应激基因葡萄糖调节蛋白75(grp75)的表达变化.结果 Gln能使离体细胞在缺糖应激下存活率增加、凋亡率降低,线粒体跨膜电位稳定;动物实验显示Gln能减轻动物因缺血造成的脑损伤;免疫细胞化学法、Western blot印迹法检测结果表明Gln可以上调细胞中grp75的表达.结论 Gln对细胞缺糖损伤和动物缺血性脑损伤具有一定的保护作用,这种保护作用可能与上调细胞中的应激基因grp75的表达有关.
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葡萄糖调节蛋白75基因突变体及其真核表达载体构建
葡萄糖调节蛋白75(glucose-regulated protein 75,Grp75)与细胞内的p53结合抑制其核移位,起到了保护细胞的作用.为研究Grp75和p53的结合与否是如何影响细胞活力,现构建Grp75缺失突变基因的真核表达载体.以SOE-PCR(genesplicing by overlap extension)法得到Grp75缺失突变基因,与pcDNA3.0真核表达载体连接,构建Grp75缺失突变的特异性表达载体pcDNA3.0/Grp75(△253-282),经酶切、测序鉴定Grp75缺失突变蛋白表达载体成功构建.用脂质体将pcDNA3.0/Grp75(△253-282)转染到PC12细胞株,以1 mg/mL浓度的G418筛选出稳定株,并命名为PC12/Grp75(△253-282)(+).半定量RT-PCR和Western blot结果显示PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组内Grp75的mRNA和蛋白的表达水平较PC12细胞组增高.对PC12细胞组、PC12/Grp75(△253-282)(+)细胞组和PC12/Grp75(+)细胞组(pcDNA3/Grp75真核表达载体已构建)分别缺糖0 h、3 h、9 h、18 h和36 h,MTT法检测各组细胞活力,Hoechst33324法检测细胞凋亡情况.结果显示PC12/Grp75(+)组细胞活力高于其它两组,PC12/Grp75(△253-282)(+)组高于PC12组,差异有统计学意义.Hoechst33324染色后,凋亡细胞的比率与MTT细胞活力检测结果基本一致.Western blot检测三种细胞内p53的表达量,PC12/Grp75(+)细胞内p53蛋白表达量低于另外两组,可能是由于Grp75蛋白量的增多部分抑制了p53的表达,提示Grp75对缺糖诱导细胞凋亡的抑制作用部分与p53的结合有关.以上结果表明Grp75基因的缺失突变在一定程度上降低了细胞的活力.
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葡萄糖调节蛋白75生物学功能研究概述
葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75,grp75)是一种主要存在于细胞线粒体中的热休克蛋白(heat shock protein,HSP)[1].它行使分子伴侣的功能,协助细胞质中合成的线粒体蛋白肽链转运入线粒体,帮助肽链在线粒体中正确折叠和装配,介导异常蛋白质的降解[2].本文对grp75生物学功能的研究现状作一概述.
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缺糖损伤对PC12细胞的效应及对葡萄糖调节蛋白75的表达影响
目的:探讨缺糖损伤对PC12细胞的效应及对葡萄糖调节蛋白75(grp75)的表达影响.方法:通过形态学观察、MTT法及流式细胞术检测缺糖损伤对PC12细胞活力的影响,通过RT-PCR法检测缺糖损伤对grp75在PC12细胞中表达的影响.结果:PC12细胞在无糖培养条件下,细胞活力逐渐下降,48小时后,大部分细胞死亡,部分细胞为凋亡.而grp75的表达随着无糖培养时间的增加而上调.结论:缺糖损伤导致PC12细胞活力下降,并引起grp75的上调表达.
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沉默葡萄糖调节蛋白75对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响
目的 探讨沉默葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达对人肝癌细胞HCCLM3增殖和凋亡的影响.方法 体外培养人肝癌细胞HCCLM3,随机分为对照组、siRNA-1组、siRNA-2组,采用脂质体转染法将siRNA导入siRNA-1组(上游序列5'-GAGACGGUUUCCAAAUGAATT-3',下游序列5'-UUCAUUUGGAAACCGUCUCTT-3')、siRNA-2组(上游序列5'-GCUCUAAGGCUUCCAACCUTT-3',下游序列5'-AGGUUGGAAGCCUUAGAGCTT-3'),对照组不予干扰序列.采用Western blotting法检测各组GRP75表达,采用CCK-8法检测各组转染2、24、48、96 h细胞增殖情况,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况.结果 与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组GRP75表达明显降低(P均＜0.01),以siRNA-2组降低更明显(P＜0.05).与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组各时点细胞增殖能力均降低(P均＜0.01),且以siRNA-2组降低更明显(P＜0.01);与对照组比较,siRNA-1组、siRNA-2组细胞凋亡率均明显升高(P均＜0.01),且siRNA-2组升高更明显(P＜0.01).结论 沉默GRP75表达可抑制人肝癌细胞HCCLM3增殖活性,并促进其凋亡.
