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高氧对胎鼠肺Ⅱ型上皮细胞EGF、TGFβ1信号通路的影响
目的 研究高浓度氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)EGF、TGFβ1信号通路及呼吸抑制拮抗基因Sprouty2表达的影响.方法 将原代培养的胎鼠AECⅡ随机分为空气和高氧两个组,观察细胞形态学变化;Annexin V和PI双标记流式细胞仪检测细胞凋亡;实时定量PCR法检测细胞Sprouty2 mRNA的表达;Western blot法检测细胞Sprouty2、EGF受体、磷酸化EGF受体(Tyr1148)、磷酸化EGF受体(Tyr845)、TGF-8Ⅱ型受体蛋白表达.结果 AECⅡ暴露于高氧后,细胞贴壁不紧,长势欠佳.高氧组早期凋亡细胞明显增多(P＜0.05);高氧暴露后24和36 h,Sprouty2 mRNA及蛋白表达随高氧暴露时间延长而增加(P＜0.05);高氧暴露后24和36 h,EGF受体、磷酸化EGF受体(Tyr1148)、磷酸化EGF受体(Tyr845)表达均减少,而TGF-βⅡ型受体蛋白表达增加(P＜0.05).结论 高氧暴露通过下调EGF信号和上调TGFβ1信号,进而使Sprouty2表达增加,增加的Sprouty2与AECⅡ凋亡相关.
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成纤维细胞生长因子信号调控早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移
目的 利用Sprouty2基因阻断成纤维细胞生长因子(FGF)信号,探讨FGF在早期鸡胚胎发育过程中对神经嵴细胞迁移的影响及其机制. 方法 通过体内培养的方法孵育鸡胚至HH9期,通过显微注射的方法将Sprouty2-绿色荧光蛋白(GFP)质粒注射入神经管腔内.实验侧使用电穿孔转染的方法转染胚胎半侧神经管,另一侧正常神经管设为对照侧.采用神经嵴细胞特异标记物HNK1免疫荧光的方法检测Sprouty2基因阻断FGF信号后是否影响胚胎头部和躯干部神经嵴细胞的迁移过程.随后,进一步通过检测神经细胞钙黏分子N-Cadherin的表达来观察细胞之间黏附作用的改变. 结果 HNK1免疫荧光检测结果显示,Sprouty2转染侧即阻断FGF信号通路后,HNK1在早期鸡胚胎的头部和躯干部的表达量均比对照侧的表达量增多；而神经细胞钙黏分子N-Cadherin检测结果表明,Sprouty2转染侧和正常对照侧N-Cadherin在头部和躯干部神经管上表达量的差异均无显著性. 结论 Sprouty2基因阻断FGF信号后,促进了早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移,但是FGF信号对此过程的影响可能不是由神经钙黏分子N-Cadherin介导的.
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miR-27a 通过调控 Sprouty2促进胰腺癌细胞 PANC-1的生长
目的探讨miR-27 a在胰腺癌细胞生长过程中的作用及相关机制。方法应用RT-PCR检测胰腺癌组织中miR-27a的表达水平；应用CCK-8生长曲线和软琼脂克隆形成实验检测miR-27a对胰腺癌细胞PANC-1生长能力的影响；应用双荧光素酶报告基因实验和 Western blot 筛选 miR-27a 的靶基因。结果（1）相比较于癌旁正常胰腺组织，胰腺癌组织中miR-27a表达显著上调；（2）抑制胰腺癌细胞PANC-1内源性miR-27a能够显著下调癌细胞的生长活性；（3）miR-27a能够直接调控Sprouty2基因3′UTR中的MRE序列；（4）抑制PANC-1细胞内源性miR-27a能够显著上调Sprouty2蛋白35％。结论 miR-27通过调控胰腺癌细胞PANC-1中Sprouty2蛋白表达发挥癌基因功能。
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运用RNAi技术构建Sprouty2低表达肾癌细胞株的实验研究
目的 构建Sprouty2低表达肾癌细胞株,以进一步研究Sprouty2蛋白在肾癌发病机制中的生物学功能.方法 采用RNAi技术,构建3组质粒,分别转染肾癌细胞系786-0,建立Sprouty2低表达肾癌细胞株,并运用Western blot检测细胞Sprouty2的表达.结果 成功构建Sprouty2 siRNA质粒,转染肾癌细胞后转染组可见绿色荧光蛋白表达,Western blot检测显示Sprouty2表达降低.结论 运用RNAi技术可成功诱导786-0细胞系中Sprouty2蛋白表达降低,为进一步研究蛋白功能提供实验基础.
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miR-122通过介导sprouty2调控肾癌细胞的增殖
目的:研究miR-122在肾癌发生中的作用以及与sprouty2之间的关系.方法:通过RT-qPCR实验,测定32对肾癌组织及邻近癌旁组织中miR-122的表达水平.将miR-122抑制剂(miR-122 inhibitor)转染至肾癌细胞株786-0和CAKI-1中,下调miR-122的表达,在不同时间点,CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,RT-qPCR和Western blot检测sprouty2mRNA和蛋白表达情况.通过双荧光报告素酶基因实验,研究miR-122与sprouty2 3'UTR结合情况.结果:miR-122在肾癌组织中表达明显升高(P＜ 0.05);miR-122 inhibitor转染后能够抑制肾癌细胞增殖(P＜0.05)及导致细胞周期阻滞(P＜0.05),并促进肿瘤细胞中sprouty2蛋白的表达(P＜0.05);双荧光报告素酶基因实验表明miR-122 inhibitor能与sprouty2 3'UTR结合,显著升高荧光值(P＜0.05).结论:miR-122促进肾癌细胞的增殖,sprouty2可能是miR-122的靶基因.
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三阴型乳腺癌中FOXO3a与SPROUTY2的表达及其临床意义
目的 探讨FOXO3a与SPROUTY2(SPRY2)在三阴型乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)中的表达及其相关性.方法 采用免疫组化EnVision两步法检测TNBC组织和正常乳腺组织中FOXO3a与SPRY2的表达,并分析两者与TNBC临床病理特征的关系.结果 TNBC组织中FOXO3a与SPRY2表达显著低于正常乳腺组织(P<0.01).秩和检验结果显示,TNBC中FOXO3a与SPRY2的表达与组织学分级及淋巴结转移呈负相关.Spearman相关性分析结果显示,TNBC中FOXO3a与SPRY2的表达呈正相关(P<0.001).结论 TNBC中FOXO3a与SPRY2的表达呈正相关,两者在TNBC中起抑制作用,可能存在调控关系,从而抑制淋巴结转移.FOXO3a与SPRY2可作为新的判断预后的重要因子,并为临床基因靶向治疗提供新的理论依据.
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金雀异黄素通过调控miR-27a及其靶基因对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响
目的:研究金雀异黄素对卵巢癌细胞株SKOV3生长的抑制作用及其可能的机制.方法:收集卵巢癌组织及良性组织,应用RT-PCR法检测miR-27a的表达.用不同浓度的金雀异黄素处理细胞,通过SRB法检测金雀异黄素单用或加入miR-27a mimics后对细胞株生长的抑制作用；经RT-PCR和Western blot检测miR-27a及靶基因Sprouty2表达的变化.结果:miR-27a在卵巢癌组织中的表达高于良性组织(P＜0.05).金雀异黄素可呈浓度和时间依赖的方式抑制卵巢癌细胞SKOV3生长；金雀异黄素浓度依赖性地下调miR-27a,上调Sprouty2的表达,且miR-27amimics能够部分拮抗金雀异黄素抑制细胞生长的作用.结论:金雀异黄素可能通过下调致癌miR-27a的表达,发挥抑制卵巢癌细胞生长的作用.
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Sprouty2蛋白在胃癌组织中的表达及其意义
目的:探索Sprouty2(SPRY2)在胃癌及癌旁组织中的表达情况,分析其表达水平与临床病理因素及患者预后的相关性.方法:采用免疫组织化学的方法检测了121例胃腺癌标本中Sprouty2的表达.通过卡方检验评估了SPRY2表达与临床病理因素的相关性,并通过Kaplan-Merier法计算了SPRY2与总体生存率的关系,即SPRY2的预后意义.通过实时定量PCR的方法,我们检测了11对肿瘤组织和癌旁正常组织中SPRY2的mRNA水平并加以比较.结果:SPRY2在121例胃癌组织较低表达80例,较高表达41例,胃癌组织SPRY2表达水平较癌旁组织表达量显著降低.通过卡方检验证明SPRY2的表达与淋巴结转移(P<0.001)和TNM分期明显相关(P=0.004).Kaplan-Meier生存分析证明SPRY2低表达组与高表达组的病人存在显著的总体生存率的差异.SPRY2可以作为胃腺癌的一个预后标记物.结论:SPRY2高表达与胃癌病人不良预后明显相关,可作为胃癌预后的评价指标.
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SIAh2与Sprouty2在肝细胞癌中的表达及临床意义
目的:探讨SIAh2与Sprouty2在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况及二者的相关性.方法:通过免疫组化方法检测51例肝癌组织、33例癌旁组织(取距癌灶2 em的组织)及16例正常肝组织中SIAh2及Sprouty2的表达.结果:SIAh2在HCC中的表达阳性率高于癌旁组织及正常肝组织,且癌旁组织表达阳性率高于正常肝组织,而Sprouty2在HCC中的表达阳性率低于癌旁组织及正常肝组织,差异均具有统计学意义(P＜0.05).SIAh2及Sprouty2在HCC中表达的阳性率与肿瘤分化程度及肿瘤大小呈负相关(P＜0.05).结论:SIAh2在HCC中高表达,而Sprouty2在HCC中低表达,二者呈负相关,SIAh2及Sprouty2可能影响HCC的发生、发展.
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微小RNA-27a在肝癌组织的表达及其机制
目的 检测微小RNA(miRNA,miR)-27a在肝癌中的表达,探讨miR-27a在肝癌细胞中的功能和作用机制.方法 采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测miR-27a在肝癌组织中的表达,细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞增殖实验检测miR-27a对肝癌细胞的增殖影响,荧光素酶报道载体系统验证miR-27a对Sprouty2(Spry2)基因3'非翻译区的作用,Real-time PCR检测miR-27a对Spry2基因mRNA的抑制作用.结果 miR-27a在肝癌组织的表达量(0.62±0.54)比癌旁组织(0.26±0.13)显著上调(P＜0.01),而且肝癌肿块越大的患者miR-27a的表达越高(＞5cm组0.92±0.66,≤5 cm组0.37±0.27,P＜0.05),提示miR-27a的表达与肿瘤大小呈正相关.CCK-8结果显示miR-27a可显著促进肝癌细胞的增殖(0、24、48、72 h的吸光度值分别为:对照组0.54±0.01、0.74±0.04、0.94±0.03、1.23±0.07,miR-27a转染组0.55±0.01、0.71±0.02、1.02±0.08、1.59±0.09,P＜0.01).荧光素酶报道载体结果说明miR-27a直接作用于Spry2基因的3'非翻译区(miR-27a野生型组抑制率约40％,突变型组约5％).Real-time PCR检测结果说明miR-27a对Spry2基因的mRNA有显著的抑制作用(miR-27a转染组0.0065±0.0005,对照组0.0120±0.001 0,抑制率约47％,P＜0.05).结论 miR-27a在肝癌中高表达,可通过抑制抑癌基因Spry2的表达促进肝癌细胞的增殖.
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Sprouty2蛋白表达对肾癌细胞功能影响的实验研究
目的 研究Sprouty2蛋白的表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学功能的影响.方法 采用RNAi技术,构建质粒转染肾癌细胞系786-O,建立Sprouty2低表达细胞株,通过MTT、Transwell等技术研究Sprouty2蛋白的表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响.结果 成功构建Sprouty2低表达肾癌细胞系.当Sprouty2表达水平下调后,肾癌细胞的增殖、侵袭能力增强,与对照组及空质粒转染组比较差异有显著性(P<0.05).结论 Sprouty2的表达对肾癌细胞的功能有一定影响,Sprouty2表达越低,肾癌细胞的增殖及侵袭力越强.
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慢病毒载体介导SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖作用的影响
目的 探讨慢病毒表达载体介导的人SPROUTY2基因过表达对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖、克隆性生长和细胞外调节蛋白激酶(ERK)抑制剂敏感性等生物学特性的影响.方法 克隆人SPROUTY2基因,构建SPROUTY2基因与绿色荧光蛋白(GFP)的重组慢病毒表达载体LV-S-GFP及对照载体LV-GFP.脂质体法包装病毒;优化慢病毒感染RPMI8226细胞的条件;荧光显微镜观察GFP表达;反转录聚合酶链反应(PCR)、蛋白质印迹法(Western blot)方法分别检测目的基因及其蛋白的表达,CCK-8法检测RPMI8226细胞增殖及其对ERK 1 /2抑制剂AS703026敏感性的影响,软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆性生长能力.结果 成功地构建了共表达SPROUTY2基因和报告GFP的高滴度慢病毒颗粒.LV-S-GFP实验组RPMI8226细胞中SPROUTY2的表达明显高于LV-GFP对照组,灰度值分别为(230.85±32.12)％和(140.35±36.62)％(P＜ 0.05).过表达SPROUTY2基因对骨髓瘤细胞增殖具有抑制作用,并可以增强ERK1/2抑制剂AS703026对RPMI8226细胞的杀伤作用.过表达SPROUTY2基因可明显抑制RPMI8226细胞的克隆性生长.结论 慢病毒载体系统可高效介导SPROUTY2基因在RPMI8226细胞中的表达,抑制骨髓瘤细胞增殖及克隆性生长,并能够提高其对ERK抑制剂的敏感性.
