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2型重组腺相关病毒体外转导培养细胞的研究
为揭示2型重组腺相关病毒感染哺乳动物细胞的一些转导特征,构建并制备了一种携带萤火虫荧光素酶基因的重组2型腺相关病毒rAAV2-Luc,研究了该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系;肝素对转导的拮抗作用;rAAV2的竞争抑制作用;丁酸钠对表达水平的增强作用.结果显示,在一定范围内,随着rAAV2-Luc感染细胞的感染复数(MOI即每个细胞感染的病毒基因组数)值增高,荧光素酶的表达水平也增高;但更高的MOI(＞107)反而使荧光素酶的表达水平下降.肝素可特异性阻断rAAV2介导的荧光素酶表达.携带不同基因的2种rAAV2病毒相互具有明显的竞争抑制作用.丁酸钠可显著增强rAAV2介导的荧光素酶表达水平.本研究对rAAV2载体介导的基因转移研究具有一定的指导意义.
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2型重组腺相关病毒对人脐血CD34+造血干/祖细胞的转导效率研究
为探讨2型重组腺相关病毒(rAAV-2)载体能否有效地转导脐血CD34+造血干/祖细胞,采用rAAV-2/GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干/祖细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达.结果显示,转导19小时后感染复数(MOI)为2×105时,CD34+细胞GFP基因的表达率为43%.结论:rAAV-2能有效地转导脐血CD34+造血干/祖细胞.
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携带CML28基因的2型重组腺相关病毒的构建及体外转染树突状细胞
目的 构建携带肿瘤抗原CML28基因的2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV2/CML28),检测其体外转染人树突状细胞(dendritic cells,DCs)后对DCs的影响和目的 基因CML28的表达.方法 将CML28基因克隆到2型重组腺相关病毒载体系统(AAV Helper-Free System)中的真核表达质粒pAAV-IRES-hrGFP,将酶切和DNA测序鉴定后的重组表达质粒pAAV-CML28-hrGFP与AAV Helper-Free System 中的病毒包装辅助质粒pAAV-RC和pHelper以磷酸钙法共转染AAV-293细胞,制备携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28.rAAV2/CML28转染体外培养的DCs, RT-PCR法检测CML28的表达,流式细胞术检测DCs的表面分子和rAAV2/CML28转染DCs的效率.结果 流式细胞术证实构建并包装了rAAV2/CML28,该病毒对DCs的转染效率接近30%,病毒转染DCs检测到CML28的表达以及高水平的HLA-DR,CD80,CD83和CD86表达.结论 成功构建了携带CML28基因的重组腺相关病毒rAAV2/CML28,该病毒介导目的 基因在DCs内表达,DCs的成熟没有因病毒转染受到不良影响,为应用CML28转基因DCs诱导CML28特异性抗肿瘤免疫研究奠定了基础.
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2型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白在大鼠骨髓间充质干细胞的表达
目的:观察携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)转导骨髓间充质干细胞(MSCs)的效率、表达时间及对细胞增殖的影响.方法:体外培养出MSCs,经传代5次、鉴定后分为2组,rAAV2组中按感染复数106加入0.1 ml rAAV2-EGFP;PBS组中加入0.1 ml PBS,培养后再传代5次.用流式细胞仪检测2组P5和P10代细胞EGFP转导率,同时绘制2组P10细胞生长曲线.结果:rAAV2组P5和P10代MSCs转导率分别为21.71％±1.02％、20.34％±1.13％,差异无统计学意义(P=0.862).生长曲线显示rAAV2组细胞生长较PBS组缓慢.结论:rAAV2-EGFP转导MSCs效率可,表达时间长,对细胞增殖稍有影响,标记后的细胞可用于观察干细胞在体内的存活、迁徙及分化.
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2型腺相关病毒转导人骨髓CD34+细胞与间充质干细胞
目的:探讨2型重组腺相关病毒(AAV2)载体能否有效转导人骨髓CD34+细胞与间充质干细胞.方法:构建、包装、纯化携带绿色荧光蛋白基因的2型重组腺相关病毒(rAAV22/GFP),转染骨髓CD34+造血干/祖细胞和间充质干细胞,转导后48 h在荧光显微镜下观察GFP的表达,并比较羟基脲(HU)处理前后rAAV2/GFP 对CD34+细胞的转染效率.结果:rAAV2/GFP对CD34+细胞的转染效率为5.3%±1.7%.经羟基脲预处理后达13.2%±2.8%,rAAV2/GFP对间充质干细胞的转染效率为23%±3.6%.结论:rAAV2对间充质干细胞的转染效率高于骨髓CD34+细胞,羟基脲预处理可以明显提高rAAV2对CD34+细胞的转染效率.
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乙型肝炎表面抗原基因重组2型腺相关病毒的免疫原性研究
目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性.方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cDNA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表达;RIA法检测血清中表面抗体(抗一HBs)滴度;51Cr释放分析检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性.结果外源性HBsAg基因己整合到肝细胞染色体DNA并有效地转录和翻译,表达水平高可达33.8pg/(mglivertissue),rAAV-HBsAg免疫小鼠后可以诱导机体产生表面抗体并激发特异性CTL.结论外源性HBsAg基因可以转移到小鼠肝细胞并稳定表达;rAAV-2-HBsAg免疫小鼠可以同时诱导体液和细胞免疫反应的出现.提示基于rAAV-2载体的乙型肝炎(HBV)疫苗,对于防止HBV感染,尤其是作为慢性乙型肝炎的治疗性疫苗可能只有潜在的应用价值,值得做进一步的系统研究.
关键词： 乙型肝炎表面抗原 基因表达 2型重组腺相关病毒 细胞毒性T淋巴细胞活性 -
2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白对培养神经干细胞转染效率的研究
为探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,rAAV-2)载体能否有效地转染神经干细胞(neural stemcell,NSC),本研究采用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)报告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP);以感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为1×104、1×105、1×106转染体外培养大鼠胎鼠神经干细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达.同时,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况,以评估rAAV-2对NSC存活、增殖、分化能力的影响.并利用流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSC的转染效率.结果显示,转染10 d后各转染组可观察到NSC克隆球发出绿色荧光,起始荧光强度不一,同时荧光强度随时间的延长而逐渐增强.转染21 d后荧光强度达高峰并维持在高水平.流式细胞仪检测结果表明:MOI为1 ×104、1×105、1×106时转染率分别为26 34%、50.97%、56.36%,荧光指数(FI)分别为4.01、12.70、14.08.转染组和未转染组细胞培养7、14、21 d时其细胞活力、增殖倍数、分化均无统计学差异.本实验初步证明rAAV-2能有效地转染NSC.
