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大肠埃希菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究
目的 通过分离鉴定大肠埃希菌噬菌体,研究其生物学特性. 方法 利用噬菌斑法从环境污水中分离和鉴定大肠埃希菌噬菌体,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;提取噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线. 结果 通过噬菌斑法分离出9株大肠埃希菌噬菌体.电镜显示,噬菌体头部呈立体对称,有一长尾.琼脂糖凝胶电泳显示,噬菌体基因组大小约30 kb.生长曲线表明噬菌体感染宿主菌的潜伏期为23 min,爆发时间为39 min,裂解量为78. 结论 9株大肠埃希菌噬菌体中有6株具有较广的噬菌谱,潜伏期短,裂解量明显,为深入研究大肠埃希菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据.
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流感病毒H1N1在MDCK细胞的培养及纯化条件的优化
目的 优化流感病毒H1N1在狗肾细胞(MDCK)上的培养条件,高效扩增流感病毒.方法 对MDCK细胞培养流感病毒时添加的胰酶(TPCK-Trypsin)浓度和培养基的种类进行筛选;比较不同细胞代次的MDCK对流感病毒的易感性;按MOI值0.001、0.01、0.1接种H1N1于MDCK细胞,CPE＞75％时收获病毒上清,并按MOI值0.001接种H1N1后连续培养,分别于1、2、3、4、5d收获病毒上清,HA试验检测上清病毒滴度,浓缩纯化后行TCID30检测,分别选取佳接种MOI值和收毒时间;对浓缩纯化病毒的红细胞吸附方法进行检验.结果 通过对比,确定TPCK-Trypsin的佳使用浓度是0.25 μg/ml,MEM为培养病毒的佳培养介质;代次低的MDCK对流感病毒的易感性强于代次高的MDCK细胞;按MOI值0.001接种H1N1于MDCK细胞,第3d收获的上清病毒滴度高,为1∶1 024;用红细胞吸附法浓缩纯化流感病毒的Log 1/TCID50为8.5.结论 选用MEM,添加0.25 μg/ml TPCK-Trypsin,使用低代次MDCK,病毒接种含量MOI=0.001为H1N1佳培养条件,红细胞吸附法能高效浓缩纯化培养上清中的H1N1.
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Lentivirus载体对许旺细胞的转染效率
背景：近年来研究较多的LV载体，因其强大的转染能力以及较高的转染效率等特点，在基因转染的实验中应用越来越广泛。
目的：进一步验证Lentivirus载体在体外对原代许旺细胞的转染效率。
方法：以Lentivirus三质粒系统构建病毒载体，在体外分别以MOI值为1，5，10，20，40对原代大鼠许旺细胞进行转染，转染后第1，3，5，7，9天在荧光显微镜下观察Lentivirus携带的荧光表达情况，并在显微镜的计数方格内计算细胞的转染情况。发出绿色荧光的为转染成功的许旺细胞，否则认为没有转染病毒载体的，从而算出转染效率。
结果与结论：在病毒转染3 d后，在各不同MOI值的培养孔中，均能观察到极少量的荧光反应，在第5天时，荧光数量较前明显增多。第7天时达到高峰，第9天的荧光数量与第7天变化不明显。从细胞转染效率来看，不同的MOI值明显不同，MOI值为1时的转染效率约为45%，MOI值为5时为80%，MOI值为10时为90%， MOI值为20时为78%，MOI值为40时转染效率为70%。 -
腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞的效率及毒性
背景:重组腺病毒对细胞生长、存活存在一定的毒性反应,其适感染复数的确定相关研究较少.目的:研究重组腺病毒在不同感染复数下其转染效率、细胞毒性及对骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的影响.方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺毒载体分别以感染复数为0,50,100,150,200,250转染第5代骨髓间充质干细胞.转染24 h后观察细胞形态,锥虫蓝染色计数死亡率;转染48 h后荧光倒置显微镜下计算转染率,qPCR检测EGFP及Runx2基因表达量.MTT法评价不同感染复数转染对细胞活性的影响,确定佳感染复数.结果与结论:①随感染复数值增加,骨髓间充质干细胞贴壁能力减弱,部分细胞老化、死亡;②以感染复数值为0,50,100,150,200,250转染24 h,其细胞死亡率依次为5.80%,6.67%,7.95%,7.76%,10.35%,11.18%,死亡率与感染复数值成正相关;③当感染复数值为100时即可达到大转染效率,但当感染复数增大至200时,细胞活性即受到影响;当感染复数达到250时,骨髓间充质干细胞成骨分化潜能受到影响;④通过上述结果可以认为,腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞的感染复数安全范围为50-150,其适感染复数为100.
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重组腺病毒载体介导人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞增殖与凋亡的影响
背景:基因工程在人类治疗恶性肿瘤的过程中起着重要作用,腺病毒是常用的基因工程载体,近年来发现乳铁蛋白在多种肿瘤的发生、发展及转移中有着重要作用,但目前对于乳铁蛋白通过腺病毒载体导入人体内的表达情况的研究报道目前还比较少.目的:观察重组腺病毒载体介导的人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞的增殖及凋亡的影响.方法:通过体外培养小鼠宫颈癌原代细胞,采用SP法分选出宫颈癌干样细胞,将构建好的载有乳铁蛋白的重组腺病毒载体人乳铁蛋白转染于宫颈癌干样细胞,分组为空白对照组、空病毒组和重组腺病毒人乳铁蛋白组.而在人乳铁蛋白感染宫颈癌干样细胞后,通过MTT法检测人乳铁蛋白感染后宫颈癌干样细胞的增殖情况,划痕实验检测宫颈癌干样细胞的迁移,通过Western blot法检测乳铁蛋白在宫颈癌干样细胞内的表达,采用Annexin V-FITC/PI法测定宫颈癌干样细胞的凋亡情况.结果与结论:与其他2组相比,重组腺病毒人乳铁蛋白组宫颈癌干样细胞增殖数量及划痕处细胞的数目减少,凋亡细胞增加(P<0.05或P<0.01).结果证实,载有乳铁蛋白的重组腺病毒载体人乳铁蛋白用于感染体外培养的宫颈癌干样细胞后,能稳定在宫颈癌干样细胞内表达,且能明显抑制宫颈癌干样细胞增殖,减少细胞迁移,并促进细胞凋亡.
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两种方法制备的水痘-带状疱疹病毒(Oka株)毒种感染2BS细胞的敏感性
目的 用现有方法及新方法分别制备水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)(Oka株)毒种,比较两种方法制备的毒种对2BS细胞的感染复数及增殖动态差异.方法 用现有方法(用含2％小牛血清的病毒维持液于-70℃条件下冻存Oka株毒种)和新方法(用含90％小牛血清的病毒冻存液于-196℃条件下冻存Oka株毒种)制备第47代Oka株VZV毒种,采用不同的MOI(0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1)感染第37代2BS细胞,观察细胞病变(CPE)情况,收获不同MOI接种和培养不同时间点病毒制备疫苗,采用噬斑法检测疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性,确定两种方法制备的毒种对2BS细胞感染的适MOI.结果 现有方法制备毒种以0.01 ～0.1 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期;新方法制备毒种以0.001 ～0.01 MOI感染2BS细胞72 h后,病变达到高峰期.两种方法收获的病毒液制备的成品疫苗的病毒滴度为4.4 ～4.6 lgPFU/ml,37℃放置1周,病毒滴度3.8～4.0 lgPFU/ml;疫苗原液、成品滴度以及37℃稳定性无差异,均达到本公司水痘减毒活疫苗制造与检定规程制定的相关标准.结论 现有方法和新方法制备的毒种适MOI分别为0.01～0.1和0.001～0.01,新方法制备的毒种更适合水痘疫苗的生产.
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鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备
目的 建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础.方法 通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID50),并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性.结果 NB324K细胞的佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48 h及2 h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48 h收获,病毒滴度高.制备的病毒液的平均滴度为8.69 CCID50/ml,4℃和37℃保存7 d及反复冻融5次,稳定性良好.结论 已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础.
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水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)中感染复数的分析
目的 探讨水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)在人二倍体细胞(2BS株)上的感染活性,确定感染复数(MOI).方法 使用100 ml小方瓶培养人二倍体细胞(2BS株),待长成致密单层后,接种病毒滴度为5.5 lgPFU/ml的水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株),每瓶接种量分别为0.02、0.1、0.3、0.5、0.8、1、1.5和2 ml,于显微镜下连续观察细胞病变情况及病变比例,并连续记录收获时间;采用蚀斑法测定病毒滴度.结果 当病毒接种量为0.02 ml时,细胞大部分生长正常,呈极性排列,无形态典型、广泛的病变,通过延长收获时间也无法获得形态典型、广泛的病变;当病毒接种量不低于0.1ml时,呈典型、广泛的病变,随着病毒接种量的增加,收获时间逐渐缩短;仅病毒接种量为0.02 ml组细胞的病毒滴度低于3.7 lgPFU/ml;确定MOI在0.004 0 ～0.019 9之间,均可制备出质量稳定、符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求的毒种.结论 确定了水痘-带状疱疹病毒(VZV84-7株)感染人二倍体细胞(2BS株)合适的MOI,为水痘疫苗生产工艺的优化提供了参考依据.
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感染复数对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞中增殖的影响
目的 观察不同感染复数(MOI)对Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞巾增殖的影响.方法 分别用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒感染Vero细胞,观察不同MOI致细胞病变情况,并检测病毒滴度.结果 病毒感染Vero细胞后48 h,3组MOI(0.001、0.01、0.1)细胞病变均达(州).Ⅰ型病毒增殖高峰出现在接种后72 h,3组MOI病毒滴度分别为(8.690±0.190)、(8.690±0.190)和(8.315±0.185)IgCCID50/ml;Ⅱ型病毒增殖高峰出现在接种后96 h,3组MOI病毒滴度分别为(8.355±0.097)、(8.440±0.310)和(8.285±0.155)IgCCID50/ml;Ⅲ型病毒增殖高峰出现存接种后48～96 h,3组MOI病毒高滴度分别为(7.500±0.250)、(7.500±0.250)和(7.750±0.250)igCCID50/ml.结论 不同MOI对3型病毒增殖影响不大,可以采用低MOI(0.001)制备疫苗.
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人源KOR-GFP融合蛋白在昆虫细胞中的表达和活性鉴定
通过PCR方法扩增人源kappa型阿片受体基因(hKOR)和GFP基因,然后采用重叠延伸PCR(SOEPCR)将hKOR与GFP基因连接,并将融合基因通过无缝克隆技术克隆入pFastBac1载体,将筛选的阳性重组载体转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10αBac感受态细胞获得重组杆粒Bacmid-hKOR-GFP.采用重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,收获上清作为重组病毒P1代,采用流式细胞术检测病毒感染效率;采用Western blot 鉴定hKOR-GFP的表达情况;采用cAMP酶联免疫方法检测hKOR-GFP的功能活性.结果表明,采用感染复数(MOI)值为2,感染后72 h,hKOR-GFP在Sf9昆虫细胞中可达到高效表达;Western blot实验表明hKOR-GFP在昆虫细胞中获得正确表达;cAMP酶联免疫实验结果证明在激动剂存在下,Sf9细胞内cAMP含量出现剂量依赖性下降,表明hKOR-GFP具有生物活性.在昆虫细胞中高效表达具有功能活性的hKOR-GFP可为建立非成瘾性镇痛药物筛选技术平台奠定基础.
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RIP140重组腺病毒的构建及在乳鼠心肌细胞中的表达
目的：原代乳鼠心肌细胞为终末期的分化细胞，常规的质粒转染效率低下。受体相互作用蛋白140（receptor-in-teracting protein 140，RIP140）目的基因长达3.5kb，为研究RIP140蛋白在非增殖型的心肌细胞表达情况，需要寻找一种更好的过表达系统。方法 RIP140基因全长序列克隆入pAdTrack-CMV穿梭载体中，在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1进行同源重组。经酶切及测序验证的阳性重组克隆转染入AD293细胞中进行病毒的包装与扩增。采用TCID50法测定病毒滴度、CCK-8试剂盒分析腺病毒对心肌细胞活力的影响。采用Western blot鉴定RIP140蛋白在心肌细胞中的表达情况。结果测序分析结果表明RIP140的全长序列正确克隆到 AdEasyTM腺病毒系统中。Ad-RIP140、Ad-GFP 的病毒滴度分别为1011.3和1011.7 PFU · mL－1。腺病毒感染复数在200以下时，对心肌细胞活力无影响。绿色荧光及Western blot分析显示Ad-RIP140感染心肌细胞12 h，RIP140表达明显增加（P＜0.05）。结论成功构建了RIP140全长序列的腺病毒载体，并使其蛋白有效表达于心肌细胞中，这将有助于后续进行RIP140在心肌细胞中的作用的研究。
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HCMV AD169株感染复数(MOI)的确定
目的 通过蚀斑形成试验测定人巨细胞病毒(HCMV)AD169株的蚀斑(PFU)确定其感染复数(MOI)并纯化病毒.方法 HCMV AD169株接种7～8代HF细胞单层,37℃吸附,0.007琼脂糖覆盖层,1周后加第2层覆盖,2周后用0.000 5结晶紫染色5 min,记数,计算PFU及MOI;染色前,镜下挑取蚀斑保藏并鉴定.结果蚀斑经0.000 5结晶紫染色在HF细胞单层上呈紫色,很易识别,散在均匀分布,着色深,与周围区域界限明显,MOI=3.41×104.结论探索出HCMV AD169株感染复数(MOI)的测定方法.
关键词： 巨细胞病毒属/分离和提纯 蚀斑 感染复数 -
CVB3m激活胞外信号调节激酶(ERK)信号途径
目的了解细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)途径在柯萨奇病毒B3感染中的作用.方法感染复数MOI＝10的CVB3m或PBS感染生长停滞的HeLa细胞1小时,在指定时间收集细胞裂解液后应用免疫印迹分析感染后不同时间ERK1/2的磷酸化以了解Raf/MEK/ERK途径的活化.结果 CVB3m感染引起HeLa细胞ERK1/2的二次激活.第一次激活在感染后10min即可检出,持续至感染后1h,随后P-ERK1/2水平降至基础.在感染后7h再次激活并一直持续激活至感染后24h,在感染后12h达到峰值.结论 CVB3m感染二次激活ERK1/2途径,即早期短暂激活和晚期的持续激活.ERK1/2途径可能在CVB3m感染中有重要作用.
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重组腺病毒介导的β-神经生长因子基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究
[目的]探究携带β-神经生长因子(β-NGF)基因的重组腺病毒转染大鼠骨髓源内皮祖细胞(EPCs)的佳感染复数(MOI),并从基因转录和蛋白合成两个水平上观察转染后EPCs对β-NGF基因的表达,探讨其对脊髓损伤后神经元细胞微环境的影响.[方法]密度梯度离心法分离、全骨髓贴壁法培养大鼠骨髓源EPCs,免疫荧光法检测EPCs特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2的表达.用不同MOI值的携带β-NGF基因和绿色荧光蛋白基因(GFP)的重组腺病毒转染EPCs,确定佳的MOI值.用携带β-NGF基因的重组腺病毒转染的细胞为β-NGF基因组,用空载的重组腺病毒转染的细胞为空载组,未转染的细胞为空白组.RT-PCR法、Western blot法和ELISA法检测β-NGF的表达.[结果]成功分离、培养出大鼠骨髓源EPCs,特异性表面分子CD34、CD133和VEGFR-2经鉴定呈阳性表达;携带β-NGF基因的重组腺病毒转染EPCs佳的MOI为70;转染成功的细胞β-NGF基因在mRNA和蛋白两个不同的水平上表达都升高,并持续向细胞外分泌.[结论]携带β-NGF基因的重组腺病毒可成功转染EPCs,成功转染β-NGF基因的细胞能持续向细胞外分泌有活性的β-NGF蛋白.
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重组腺病毒介导β半乳糖苷酶基因转染内皮祖细胞的实验研究
目的 测定重组腺病毒介导β半乳糖苷酶基因对内皮祖细胞的转染率,为利用人类单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因转染内皮祖细胞治疗肺癌提供依据. 方法 将转染β半乳糖苷酶(LacZ)的重组腺病毒AD5F35(AD5F35LacZ)加入培养有内皮祖细胞的24孔板,转染内皮祖细胞.转染后用LacZ检测试剂盒染色,计算转染率.结果 在光学显微镜下观察,蓝色细胞为AD5F35LacZ基因转染成功的内皮祖细胞.在不同感染复数MOI的前提下,腺病毒对内皮祖细胞的转染率是不同的,在一定的范围内,转染率随MOI的增大而增大,在MOI达到400时,转染率大,为98.38%±1.25%. 结论 重组腺病毒可成功转染内皮祖细胞,转染率随MOI的增大而增大,当感染复数为400时转染率大.
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MAPREC技术检测Sabin株脊髓灰质炎病毒的基因突变率并评价疫苗神经毒力
目的:采用MAPREC技术检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(sIPV)生产收获液中病毒神经毒力决定位点的基因突变并评估疫苗神经毒力.方法:采用MAPREC技术用CY5荧光标记引物替代同位素标记检测疫苗株Sabin Ⅰ、Ⅱ型及PfizerⅢ型疫苗病毒收获液及毒种的神经毒力决定位点的突变率,并与猴体神经毒力比较;采用MAPREC技术检测在不同培养温度、传代的次数、降低病毒接种的感染复数(MOI)时病毒各位点突变率变化.结果:MAPREC方法检测显示,本研究收集的病毒收获液的突变率符合猴体神经毒力检测结果;当病毒培养条件发生改变导致突变率增加后,MAPREC检测出的神经毒力决定位点的突变率也同样增加.结论:MA-PREC技术可用于检测Sabin株脊髓灰质炎病毒的基因突变率,并评价疫苗的神经毒力.
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2型腺相关病毒重组绿色荧光蛋白对培养神经干细胞转染效率的研究
为探讨2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus 2,rAAV-2)载体能否有效地转染神经干细胞(neural stemcell,NSC),本研究采用含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)报告基因的rAAV-2(rAAV-2/EGFP);以感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为1×104、1×105、1×106转染体外培养大鼠胎鼠神经干细胞,在荧光显微镜下观察EGFP的表达.同时,检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况,以评估rAAV-2对NSC存活、增殖、分化能力的影响.并利用流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSC的转染效率.结果显示,转染10 d后各转染组可观察到NSC克隆球发出绿色荧光,起始荧光强度不一,同时荧光强度随时间的延长而逐渐增强.转染21 d后荧光强度达高峰并维持在高水平.流式细胞仪检测结果表明:MOI为1 ×104、1×105、1×106时转染率分别为26 34%、50.97%、56.36%,荧光指数(FI)分别为4.01、12.70、14.08.转染组和未转染组细胞培养7、14、21 d时其细胞活力、增殖倍数、分化均无统计学差异.本实验初步证明rAAV-2能有效地转染NSC.
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病毒感染复数对狂犬病毒PM株增殖的影响
目的：探讨不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的狂犬病毒PM株在人二倍体细胞(2BS株)中增殖的影响,确定感染复数。方法将狂犬病毒PM株按照MOI 0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20接种至2BS细胞中,用显微镜观察接种病毒后细胞的形态变化；培养3~5d后,第一次收获病毒液；更换培养液继续培养3~4d后,进行第二次收获。采用小鼠脑内滴定法测定狂犬病毒滴度,通过NIH法测定灭活病毒液的效价。结果当MOI为0.05~0.10时,细胞圆缩30%~40%,细胞能维持较好的生长形态,可收获病毒,病毒收获液的滴度较高(>5.0 lgLD50/mL),且灭活后病毒液的效价较高(>4.0IU/mL)。结论确定狂犬病毒PM株在人二倍体2BS细胞增殖的适宜MOI,为人用狂犬病疫苗生产工艺的优化提供了依据。
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慢病毒载体介导增强绿色荧光蛋白感染人脂肪间充质干细胞及其成脂分化的实验研究
目的 探讨慢病毒载体介导增强绿色荧光蛋白(EGFP)感染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的佳条件与其成脂分化能力.方法 以不同感染复数(MOI)感染hADSCs8h,在荧光倒置显微镜下观察感染效果;流式细胞仪检测感染率;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测感染前后hADSCs的增殖情况;成脂诱导14d后油红O染色,Image-ProPlus图像分析软件比较hADSCs在感染前后的成脂能力.结果 以MOI值1、10、25、50、75、100、150感染hADSCs时,其感染率依次为0.24％、13.48％、40.33％、89.27％、94.52％、98.49％和99.11％.以MOI值50感染hADSCs,比较感染前后细胞的增殖与成脂能力,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 慢病毒感染hADSCs的佳MOI值为50.
