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骨髓间充质干细胞细胞膜片复合富血小板血浆促进种植体周围骨组织再生的研究
目的: 研究骨髓间充质干细胞(BMSCs) 细胞膜片聚集体与富血小板血浆(PRP) 复合凝胶在种植体周围骨组织再生的能力.方法: 全骨髓贴壁法培养SD 大鼠BMSCs,诱导为细胞膜片并切割为1 mm2 大的碎片(BMSCs);采集SD 大鼠新鲜动脉血制备PRP;将BMSCs 膜片与PRP 复合后注入纯Ti 种植体与β-TCP 材料间隙中(BMSCs + PRP) ,分别植入裸鼠皮下(n =6);8 周后取材观察成骨情况.结果: Micro CT 及硬组织切片均显示BMSCs + PRP 组在种植体周围有更多的新生骨形成,而单纯BMSCs 膜片及单纯PRP 组几乎无新生骨形成.结论: BMSCs 膜片与PRP 联合使用可以促进β-TCP 种植体周围骨组织的再生.
关键词： 种植体 骨再生 富血小板血浆(PRP) 骨髓间充质干细胞(BMSCs) -
脂肪干细胞促进可注射性"软骨细胞砖-富血小板血浆"复合体形成异位软骨的实验研究
目的:将脂肪干细胞(ADSCs)负载入可注射性软骨细胞砖-富血小板血浆(CB-PRP)复合体中,探究其作为种子细胞能否促进异位软骨的形成.方法:成膜培养软骨细胞并制备CB;扩增培养ADSCs和骨髓间充质干细胞(BMSCs);取静脉血制备PRP;将ADSCs和BMSCs分别与CB-PRP混合并注射至裸鼠皮下,12 周后取材观测软骨形成情况.结果:体外实验显示CB由软骨细胞及细胞外基质构成;体内生长12 周后,大体观察2 组复合体均形成软骨样组织;HE染色、番红O(Safranin-O)和甲苯胺蓝(TB)染色及定量检查结果显示2 组复合体均有软骨组织形成,Safranin-O和TB染色阳性区域面积无统计学差异.结论:ADSCs能够作为种子细胞促进可注射性"软骨细胞砖-富血小板血浆"复合体形成异位软骨.
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大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞体外成骨能力的比较
目的:比较大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)与脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化能力.方法:取同一大鼠髂骨及腹股沟脂肪组织,分别提取BMSCs和ADSCs,贴壁筛选培养并传代.显微镜下观察细胞形态;用P3代细胞计数法检测细胞的增殖能力;诱导成骨后进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色以及qPCR检测成骨相关基因.结果:2种细胞均可传代至P10代,细胞形态均一,稳定;细胞增殖实验显示P3代ADSCs的增殖能力强于BMSCs;碱性磷酸酶染色及茜素红染色表明BMSCs成骨能力强于ADSCs;qPCR显示BMSCs成骨相关基因升高更为显著.结论:BMSCs和ADSCs生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,BM-SCs成骨能力强于ADSCs.
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25羟基维生素D3对糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞NLRP3炎症小体激活及炎症反应的影响
目的: 探讨25羟基维生素D3[25(OH) D3,D3]对糖尿病状态骨髓间充质干细胞(BMSCs) NLRP3炎症小体激活及炎症反应的影响.方法: 分离培养糖尿病大鼠BMSCs,免疫细胞化学染色鉴定后,将细胞分为糖尿病照组(不加D3) 、糖尿病低浓度组(D3 1 × 10-5 mmol /L) 、糖尿病中浓度组(D3 1 × 10-4 mmol /L) 、糖尿病高浓度组(D3 1 × 10-3 mmol /L),正常大鼠BMSCs作正常对照组(不加D3),免疫印迹实验检测各组细胞NLRP3等炎症反应相关蛋白的表达.结果: 分离培养的细胞具有BMSCs表面标记物特征;正常对照组、糖尿病对照组与糖尿病低浓度组细胞VDR的表达量均低于糖尿病中浓度组和高浓度组(P ＜ 0. 05);与糖尿病各组相比,正常对照组细胞低表达炎症反应相关蛋白NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6(P ＜0. 05),而糖尿病对照组与糖尿病低浓度组NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、IL-6的表达量高于糖尿病中浓度组与高浓度组(P ＜ 0. 05).结论: 25羟基维生素D3可抑制糖尿病大鼠BMSCs的NLRP3炎症小体激活及炎症反应.
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低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响
目的:观察低强度脉冲超声(LIPUS)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在钛片表面成骨分化的影响.方法:将体外培养的BMSCs分别接种于光滑钛表面和大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面,进行矿化诱导并实施超声干预和假刺激.于矿化诱导后3、7d进行碱性磷酸酶(ALP)定量检测,14 d进行ALP染色观察;矿化诱导21 d后行茜素红染色;于矿化诱导14、21 d检测成骨相关基因及蛋白表达.结果:矿化诱导后3、7d超声组ALP活性较对照组高(P＜0.05),14 d超声组与对照组相比钛片表面ALP染色明显深染;茜素红染色显示,21 d后超声组的染色更明显且形成更多的矿化结节;超声组的成骨相关蛋白成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白表达增高;RT-PCR检测到成骨相关基因、ALP、成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白均有不同程度表达增高(P＜0.05).结论:LIPUS可以促进光滑及SLA钛表面BMSCs的成骨分化.
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骨髓间充质干细胞复合脱细胞软骨和富血小板血浆的体内成骨实验
目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)和富血小板血浆(PRP)复合物中加入脱细胞软骨碎块(DCM)后的成骨能力.方法:全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs;采集兔新鲜动脉血制备PRP;剪取新鲜兔耳碎化后用化学法脱细胞制备DCM,将BM-SCs与PRP和DCM混合后注射到裸鼠皮下,8周后取材观察成骨情况.结果:体外实验显示本实验分离培养的BMSCs有较强的成骨、成脂分化能力,软骨碎块脱细胞效果理想,8周裸鼠体内结果取材苏木精-伊红染色(HE)和改良Massons染色显示类骨质和骨质较多,甲苯胺蓝(TB)染色显示剩余软骨成分较少.结论:BMSCs-PRP-DCM复合物诱导软骨内成骨.
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内皮祖细胞对骨髓间充质干细胞－种植体复合物成骨能力的影响
目的：研究内皮祖细胞（EPCs）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）膜片－种植体复合体成骨能力的影响。方法：分离培养大鼠 BMSCs 并采用细胞膜片技术培养细胞膜片；分离培养大鼠骨髓来源 EPCs；将 EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片上并检测相关基因；制作细胞膜片－种植体复合体并植入裸鼠皮下，8周取材，行 Micro-CT 检查及组织学检测。结果：体外实验显示EPCs 加载于 BMSCs 细胞膜片后成骨相关 Runx-2、ALP、BMP2和成血管相关 VEGF 的基因表达提高；裸鼠体内实验取材 Mi-cro-CT 检查显示加载 EPCs 组成骨量较高，HE 切片显示加载 EPCs 组成骨面积较多，免疫组化检测显示加载 EPCs 组 Runx2、BMP2表达较高。结论：加载 EPCs 能提高 BMSCs-种植体复合物的成骨能力。
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CKIP-1对骨髓间充质干细胞体外增殖和分化能力的影响
目的：探讨CKIP-1基因对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和分化能力的调控。方法：选择CKIP-1基因敲除型小鼠（KO）和野生型C57小鼠（WT），采用全骨髓贴壁法培养BMSCs，取第3代BMSCs，分为KO组和WT组，分别采用成骨及成脂诱导液对细胞进行诱导培养，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测目的细胞表面标记分子，用ALP染色、茜素红染色、油红O染色分别对细胞成骨及成脂能力做定量分析。结果：2种细胞增殖和干细胞分子表达相似；成骨诱导后ALP染色显示，KO组的细胞染色的阳性率要大于WT组。茜素红染色观察显示KO组的矿化结节要多于WT组；油红O染色显示KO组细胞的脂质沉淀量大于WT组。结论：CKIP-1基因缺失可以使BMSCs成骨及成脂分化能力增强，对其增殖影响不明显。
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压力对钛纳米管表面干细胞生物学特点的影响
目的：观察静压力对钛纳米管表面的骨髓间充质干细胞（BMSCs）生物学特点的影响。方法：将大鼠BMSCs分别接种于纯钛抛光（PT组）和TiO2纳米管（NT组）试件表面；常规培养24 h后，将每组试件各随机分为0 kPa组和90 kPa组（分别记为0 PT、0 NT、90 PT、90 NT），一并置于细胞液压加载装置中进行培养，并分别给予1 h／d的0 kPa和90 kPa静压力刺激。于培养1、4、7 d用CCK－8检测各组细胞的增殖能力；培养3 d时通过免疫荧光染色和场发射扫描电镜（FE－SEM）分别观察细胞的骨架及形态；培养7 d时用ALP试剂盒检测各组细胞的ALP活性。结果：纯钛抛光试件经阳极氧化处理后，在其表面制备出一层由垂直管状结构构成的阵列；培养4 d时加载90 kPa液体静压力能明显促进BMSCs在PT、NT试件表面的增殖、伪足的铺展及F－actin、ALP的表达（P＜0．05）；纳米形貌和力学刺激共同作用7 d时，BMSCs的增殖能力明显低于对照组（P＜0．05），但其伪足的伸展、F－actin、ALP的表达量均较对照组明显升高（P＜0．05）。结论：纳米形貌和液体静压力可协同影响BMSCs的增殖、细胞形态、细胞骨架及ALP表达。
关键词： 压力 纳米管 骨髓间充质干细胞(BMSCs) -
压力调控下骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞成软骨能力的比较研究
目的:探讨压力调控对BMSCs和ADSCs两种干细胞在PRF复合生长因子支持下体外成软骨效应的影响.方法:体外分离培养同一个体兔的BMSCs和ADSCs,经鉴定后诱导形成细胞膜片,分别与其同体PRF膜复合制成BMSCs/PRF、ADSCs/PRF双膜复合体.然后分别取其单膜和双膜,并各分为2组(压力刺激组和对照组),各压力刺激组置于细胞加载装置中施加以120KPa静压力刺激,每天1h;对照组常规培养.培养后2、4、6d各取一组,采用实时定量PCR检测增殖基因PCNA mRNA、以及成软骨相关基因Sox-9、Aggrecan、Col-Ⅱ mRNA的表达水平.结果:与对照组相比,无论是单膜还是双膜复合体,压力刺激均可明显上调BMSCs的细胞增殖基因以及各成软骨相关基因的表达水平(P<0.05);而对ADSCs各基因的表达均无明显作用(P> 0.05).BMSCs各组与ADSCs各组的两两相比,除单膜对照组两者各基因的表达水平无显著差异(P>0.05)外,其余各组的PCNA、Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ mRNA表达水平均为BMSCs明显高于ADSCs(P<0.05).结论:压力对BMSCs的促增殖、促成软骨效应明显强于ADSCs.
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HBV转基因小鼠与C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞分离培养的比较研究
目的 比较研究乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠和C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离培养体系.方法 采用贴壁培养法建立HBV转基因小鼠和C57BL/6小鼠BMSCs分离培养体系,通过在培养液中添加不同浓度的血清进行培养,分析HBV转基因小鼠和C57BL/6小鼠BMSCs细胞形态和数量的差异.结果 C57BL/6小鼠原代BMSCs生长迅速,按1∶3传代后呈漩涡状生长,形态类似成纤维细胞.HBV转基因小鼠原代BMSCs生长缓慢;以1∶2传代后生长缓慢,有明显的血清依赖性及密度依赖性.结论 在相同的生长环境下,不同血清浓度的培养液中,HBV转基因小鼠BMSCs生长较正常C57BL/6小鼠的BMSCs生长明显缓慢.
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诱导骨髓SSEA-1+干细胞向卵母细胞分化的初步研究
目的:探讨骨髓SSEA-1+干细胞向卵母细胞分化的潜能.方法:采用免疫磁珠分选系统(MACS)分选骨髓中SSEA-1+干细胞,接种于小鼠成纤维细胞(mEFs)饲养层上,在含1 000 U/ml白血病抑制因子(LIF)的DMEM/F 12培养液中将SSEA-1+干细胞传代培养至第2代(P2),撤去饲养层,在含20 ng/ml骨形成蛋白4(BMP4)的培养液中进行定向诱导,并分阶段加入体积分数10％人卵泡液、0.005 IU/ml卵泡刺激素(FSH)和0.003 IU/ml黄体生成素(LH).光学显微镜下观察细胞形态学变化,检测不同发育阶段生殖细胞相关特异性基因Dazl、Fragilis、Mvh、Nobox、Oct4、Stella、STRA8、Gdf9的表达.结果:骨髓SSEA-1+干细胞生殖细胞相关特异性基因表达水平均显著高于骨髓单个核细胞和SSEA-1-细胞(P＜0.0S).小鼠骨髓SSEA-1+干细胞与mEFs共培养后呈圆形,碱性磷酸酶染色阳性,显示细胞处于未分化状态.BMP4诱导7 d SSEA-1+干细胞形成细胞集落,14d可见类胚体(EB)样结构形成,21d可观察到卵母细胞样结构,且随诱导时间的延长生殖细胞相关特异性基因尤其卵母细胞减数分裂基因Stra8和Gdf9表达水平显著升高.结论:骨髓SSEA-1+干细胞具备向类卵母细胞样细胞分化的潜能.
