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CGF与脂肪干细胞联合应用修复大鼠全层皮肤缺损的研究
目的：探讨以明胶海绵为支架材料，复合浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）诱导的大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)得到的组织工程皮肤替代物，对大鼠全层皮肤缺损愈合的作用。方法：取健康雄性大鼠脂肪组织分离、培养并鉴定脂肪干细胞，观察CGF对其增殖、分化的影响。在健康雌性大鼠背部制造一直径3 cm全层皮肤缺损，其上覆盖复合脂肪干细胞的明胶海绵（A组）、无细胞的明胶海绵（B组）或不作处理单纯包扎（C组）。术后观察各组缺损的愈合情况，并于7、14、21 d及完全愈合后，取背部全层皮肤作组织学观察。结果：CGF能促进体外培养的ADSCs增殖；术后伤口渗出物、红肿等炎症反应A组
关键词： 浓缩生长因子(CGF) 脂肪干细胞(ADSCs) 创伤愈合 组织工程 -
兔脂肪干细胞(ADSCs)与聚羟基乙酸/壳聚糖(PLGA/CS)支架材料生物相容性研究
目的 探讨兔脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞复合新型聚羟基乙酸(polylactic-co-glycolic acid,PLGA)/壳聚糖(chitosan,CS)支架材料的生物相容性,为进一步构建组织工程化脂肪组织提供实验依据.方法 取雄性新西兰大白兔腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化分离出ADSCs进行培养,贴壁细胞至3～5代,评价其多向分化能力.将干细胞收集重悬后,以l×107/mL的密度接种于多孔PLGA/CS支架,形成细胞支架材料复合物.培养7天后,扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附生长和基质分泌情况,评价细胞与支架材料的生物相容性;Dil荧光标记检测细胞在支架材料上的分布;Hochest 33258检测细胞在支架上的生长情况.接种1和7天后,分别对细胞材料复合物行Annexin V/PI双染色法检测材料对细胞的毒性作用.用成脂诱导条件培养基诱导分化ADSCs及ADSCs支架材料复合物,7天后,尼罗红荧光染色液检测ADSCs在不同环境下的成脂分化能力.结果 原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观,在相应诱导条件下能够分化为脂肪细胞和骨细胞.细胞接种于PLGA/CS支架材料上第8天分裂增殖达到高峰,扫描电子显微镜下提示ADSCs在支架表面贴附生长良好,并向孔隙内壁充分延伸,细胞周围形成丰富的基质成分.活死双染结合共聚焦显微镜显示材料对细胞活性无影响,尼罗红染色可见成脂诱导后的ADSCs细胞质内有红色脂滴颗粒形成.结论 多孔PLGA/CS支架与兔ADSCs具有良好的生物相容性,可作为构建组织工程脂肪组织的支架材料.
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TGF-β1基因修饰诱导脂肪干细胞成软骨分化的实验研究
[目的]本研究通过选择对软骨细胞ECM合成具有促进作用的TGF-β1转染脂肪干细胞(ADSCs),观察转染后目的基因的稳定表达和对软骨细胞外基质(ECM)的两种重要组分:Ⅱ型胶原(type Ⅱ collage,ColⅡ)和aggrecan的合成,为构建新型的组织工程软骨提供实验依据.[方法]TGF-β1基因转染脂肪干细胞及阳性细胞克隆株的筛选;RT-PCR检测TGF-β1、纤连蛋白(fibronectin,FiN)、ColⅡ、Aggrecan的表达;Western-blot检测TGF-β1.[结果]RT-PCR结果显示:实验组(TGF-β1稳定转染组)的TGF-β1、FN、Col Ⅱ、Aggrecan的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01);Western blot检测实验组(TGF-β1稳定转染组)TGF-β1蛋白的表达较空染组和正常对照组均明显增多(P＜0.01).[结论]成功分离培养脂肪干细胞;以脂质体介导法将TGF-β1目的基因成功转染ADSCs,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多,表明转染TGF-β1基因可以促使ADSCs向软骨细胞方向分化,从而为软骨组织工程提供新的思路和方法.
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脂肪干细胞促进可注射性"软骨细胞砖-富血小板血浆"复合体形成异位软骨的实验研究
目的:将脂肪干细胞(ADSCs)负载入可注射性软骨细胞砖-富血小板血浆(CB-PRP)复合体中,探究其作为种子细胞能否促进异位软骨的形成.方法:成膜培养软骨细胞并制备CB;扩增培养ADSCs和骨髓间充质干细胞(BMSCs);取静脉血制备PRP;将ADSCs和BMSCs分别与CB-PRP混合并注射至裸鼠皮下,12 周后取材观测软骨形成情况.结果:体外实验显示CB由软骨细胞及细胞外基质构成;体内生长12 周后,大体观察2 组复合体均形成软骨样组织;HE染色、番红O(Safranin-O)和甲苯胺蓝(TB)染色及定量检查结果显示2 组复合体均有软骨组织形成,Safranin-O和TB染色阳性区域面积无统计学差异.结论:ADSCs能够作为种子细胞促进可注射性"软骨细胞砖-富血小板血浆"复合体形成异位软骨.
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大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞体外成骨能力的比较
目的:比较大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)与脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化能力.方法:取同一大鼠髂骨及腹股沟脂肪组织,分别提取BMSCs和ADSCs,贴壁筛选培养并传代.显微镜下观察细胞形态;用P3代细胞计数法检测细胞的增殖能力;诱导成骨后进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色以及qPCR检测成骨相关基因.结果:2种细胞均可传代至P10代,细胞形态均一,稳定;细胞增殖实验显示P3代ADSCs的增殖能力强于BMSCs;碱性磷酸酶染色及茜素红染色表明BMSCs成骨能力强于ADSCs;qPCR显示BMSCs成骨相关基因升高更为显著.结论:BMSCs和ADSCs生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,BM-SCs成骨能力强于ADSCs.
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PRF 及所含三因子对大鼠脂肪干细胞增殖和黏附的影响
目的：研究富血小板纤维蛋白（PRF）及其所含三因子 TGF-β1、PDGF-AB、VEGF 分别对大鼠脂肪干细胞（ADSCs）增殖和黏附的影响。方法：将 ADSCs 培养在含有 PRF 膜和不同浓度的 PDFG-AB、TGF-β1、BEGF 中，细胞黏附实验检测培养2 h 后细胞黏附能力，CCK-8法检测培养1～7 d 细胞增殖。结果：黏附实验显示，PRF 组的黏附细胞数显著高于阴性对照组（P ＜0．05）；不同浓度的 PDGF-AB 组内黏附细胞数的差异无统计学意义（P ＞0．05）；不同浓度的 TGF-β1、VEGF 组内黏附细胞数的差异有统计学意义（P ＜0．05）。CCK-8实验表明，PRF 组的细胞增殖在各个时间点（1、3、5、7 d）显著高于阴性对照组（P ＜0．05）；不同浓度的 PDGF-AB、VEGF 组内细胞的增殖差异有显著性（P ＜0．05）；不同浓度的 TGF-β1组细胞增殖的差异无显著性（P ＞0．05）。结论：PRF 能提高 ADSCs 的增殖和黏附的能力。PDGF-AB 和 VEGF 可促进 ADSCs 的增殖；TGF-β1和 VEGF 均可促进 ADSCs 的黏附，并呈一定的量效正相关。
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压力调控下骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞成软骨能力的比较研究
目的:探讨压力调控对BMSCs和ADSCs两种干细胞在PRF复合生长因子支持下体外成软骨效应的影响.方法:体外分离培养同一个体兔的BMSCs和ADSCs,经鉴定后诱导形成细胞膜片,分别与其同体PRF膜复合制成BMSCs/PRF、ADSCs/PRF双膜复合体.然后分别取其单膜和双膜,并各分为2组(压力刺激组和对照组),各压力刺激组置于细胞加载装置中施加以120KPa静压力刺激,每天1h;对照组常规培养.培养后2、4、6d各取一组,采用实时定量PCR检测增殖基因PCNA mRNA、以及成软骨相关基因Sox-9、Aggrecan、Col-Ⅱ mRNA的表达水平.结果:与对照组相比,无论是单膜还是双膜复合体,压力刺激均可明显上调BMSCs的细胞增殖基因以及各成软骨相关基因的表达水平(P<0.05);而对ADSCs各基因的表达均无明显作用(P> 0.05).BMSCs各组与ADSCs各组的两两相比,除单膜对照组两者各基因的表达水平无显著差异(P>0.05)外,其余各组的PCNA、Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ mRNA表达水平均为BMSCs明显高于ADSCs(P<0.05).结论:压力对BMSCs的促增殖、促成软骨效应明显强于ADSCs.
