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TGF-β和BDNF联合诱导成年大鼠BMSC 向神经样细胞分化的研究
目的 探讨转化因子β(TGF-β)和脑源性神经生长因子(BDNF)联合诱导成年大鼠骨髓基质细胞成神经细胞的可能性,为神经再生及脊髓损伤的治疗提供一种新方法.方法 从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞并传至第5代,诱导前2h先用含1μg/L转化因子(TGF-β)及20%FBS的DMEM培养液培养,以促进细胞分裂,然后用脑源性神经生长因子(BDNF)作诱导荆,观察细胞形态的变化,并采用免疫组织化学法检测诱导后的细胞表达NF,NSE,GFAP等特异性标志物.结果 诱导后5h,部分细胞的形态已发生改变,12h后大部分细胞不仅在形态上表现为神经元样特征.而目NF及NSE等特异性抗体呈阳性表达,而GFAP抗体表达呈阴性.结论 转化因子β(TGF-β)和脑源性神经生长因子(BDNF)能将骨髓基质细胞诱导成神经元样细胞.
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六味地黄丸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究
目的:观察滋补肝肾中药六味地黄丸体外诱导大鼠BMSCs分化为神经元样细胞的作用,为进一步探索获得较高比例神经元样细胞的诱导方法打下基础.方法:采用全骨髓贴壁分离法分离、培养SD大鼠BMSCs,鉴定后的第3代细胞经bFGF预诱导24 h后按空白组、bFGF组、六味地黄丸组进行诱导,观察细胞形态变化,诱导培养7d,采用免疫细胞化学染色法检测相关标志物巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果与结论:bFGF组、六味地黄丸组部分细胞逐渐伸出突起,多为2～3极,呈现较典型的神经元样细胞形态;均有Nestin、NSE、GFAP阳性表达,六味地黄丸组Nestin、NSE表达阳性率高于bFGF组,差异有统计学意义(P＜0.05).结果说明:(1)全骨髓贴壁分离法分离、培养的骨髓间充质干细胞能逐渐纯化,细胞活性较高,生物学性状稳定,适于做进一步研究;(2)六味地黄丸能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,可继续探讨六味地黄丸和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导是否可获得更高比例的神经元样细胞.
关键词： 六味地黄丸 碱性成纤维细胞生长因子 骨髓间充质干细胞 神经元样细胞 -
雪旺细胞促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的效应研究
目的建立一个较好的诱导骨髓间充质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞的新方法。方法应用Brdu脉冲标记MSC,使其与雪旺细胞共培养,令大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。观察细胞形态学变化,并在分化后的MSC细胞中,应用免疫细胞化学检测NSE、Brdu的表达,蛋白印迹技术检测NeuN的表达。分析诱导分化后MSC的分化率。结果与雪旺细胞共同培养的MSC表达NSE和NeuN,其分化为神经元样细胞的分化率为（80.51±5.65）%。结论 MSC与雪旺细胞共培养可以分化MSC为神经元样细胞。
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成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究
目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.
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成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究
目的 研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)向神经细胞分化的可能性.方法 利用Percoll梯度分离及贴壁筛选法分离培养和扩增MSCs;利用bFGF、化学诱导剂DMSO和BHA联合诱导MSCs向神经元转化,观察分化过程中细胞形态的变化,利用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测神经元特异性标志物的表达情况.结果 经Percoll梯度分离及贴壁筛选法获得了纯度较高的人MSCs,诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,并且分别从mRNA和蛋白水平上证明诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和NF,不表达神经胶质细胞标记物GFAP.结论 人MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞,这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞.
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新生大鼠骨源性间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化
目的探讨体外培养的骨源性间充质干细胞向神经元样细胞的分化.方法采用体外骨植块法培养骨源性的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),传代.用含0.5mmol/LIBMX,GDNF(10 ng/ml)和IL-1β(100pg/ml),中脑神经胶质细胞条件培养基和中脑神经膜碎片诱导其向多巴胺能神经元样细胞分化,免疫细胞化学检测神经细胞的表面标志NSE、MAP-2和TH.结果原代骨源性间充质干细胞含有多种细胞形态,传代后细胞成均一的梭形.诱导前,对照组少量细胞表达NSE,不表达MAP-2和TH.诱导后间充质干细胞分化成表达NSE、MAP-2和TH的细胞.结论骨源性间充质干细胞分化成神经元样细胞,表明其可跨胚层分化,同时为细胞移植治疗中枢神经系统疾病提供一种新的细胞来源.
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脂肪来源基质细胞的扩增及多分化潜能研究
目的 建立人脂肪来源的基质细胞(ADSCs)的分离和扩增方法,探讨ADSCs的多向分化潜能.方法 采用胶原酶消化法分离扩增人ADSCs,测定其生长的经时变化、累积生长倍数等;应用不同因子诱导ADSCs向脂肪细胞及神经元样细胞分化并进行鉴定.结果 每100 ml脂肪抽吸物中可分离得到2 ×107～4×107个有核细胞,60 d内扩增至P8;油红O染色、免疫细胞化学染色及RT-PCR证实ADSCs经诱导可分化为脂肪细胞及神经元样细胞.结论 建立了ADSCs的扩增培养方法,扩增培养的ADSCs具有旺盛的增殖能力,并且具有向脂肪细胞及神经元样细胞分化的潜能.有望作为一种成体多能干细胞应用于组织工程及细胞治疗.
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不同补肾法在脑梗死大鼠体内促骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用
目的 探讨不同补肾法在脑梗死大鼠体内对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法 用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)模型,随机分为空白诱导组、左归丸诱导组、地黄饮子诱导组、右归丸诱导组、维甲酸(RA)诱导组、左归丸联合RA诱导组、右归丸联合RA诱导组、地黄饮子联合RA诱导组,不同补肾法代表方药含药血清孵育BMSCs,移植后7、14 d进行移植细胞神经标志蛋白的检测.结果 诱导BMSCs经静脉移植入大鼠体内后,阳性表达神经细胞的相关蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)、Nestin及胶质纤维酸性蛋白(GFAP).结论 不同补肾法在脑梗死大鼠体内能够促BMSCs向神经元样细胞分化,且补阴类代表方左归丸和阴阳双补类代表方地黄饮子在体内诱导分化的效果优于补阳类代表方右归丸.
关键词： 不同补肾法 脑梗死 骨髓间充质干细胞(BMSCs) 神经元样细胞 细胞分化 -
小鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和分化为神经元样细胞的实验研究
目的：体外分离和扩增小鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），并观察不同方法诱导BMSCs向神经元样细胞分化的差异，以寻找一种效果理想的BMSCs体外诱导方法。方法取昆明小鼠双股骨骨髓，采用全骨髓贴壁法体外纯化扩增 BMSCs，流式细胞术检测其表面标志物，并对其进行成脂、成骨诱导鉴定。分别用化学诱导法和共培养法诱导 BMSCs分化为神经元样细胞，比较两种方法所获得的神经元样细胞的细胞形态。结果采用全骨髓贴壁法能有效分离小鼠 BMSCs，随着传代次数的增加能得到逐渐纯化的BMSCs，而过多的传代次数则出现细胞生长速度缓慢、核固缩、脱离等衰老征象。流式细胞术检测结果显示P4代BMSCs阳性表达CD29和Sca-1，而阴性表达CD11b。具有成脂、成骨诱导分化的能力。共培养法诱导第5天可见神经细胞样形态且细胞突起数量较多并有分支；化学诱导法培养第7天细胞出现较长突起，形成神经样结构。结论采用全骨髓贴壁法能有效分离纯化小鼠BMSCs ，通过共培养法诱导BMSCs分化为神经元样细胞效果优于化学诱导法。
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成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞
目的 探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(adult rat marrow mesenchymal stem cells,rMSCs)的体外增殖和特异性诱导分化为神经元样细胞的能力.方法 分别采用3种不同的诱导方法体外定向诱导第三至五代的rMSCs向神经元样细胞分化,并分别应用相差显微镜观察神经元样细胞和免疫细胞组化检测神经元样细胞所表达的神经元特异性标志[神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和神经丝蛋白(neurofilament,NF)]及星形胶质细胞特异性标志[胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acid protein,GFAP)],并进行神经元样细胞定量分析.结果 所采用的3种定向诱导方法都能使rMSCs特异性诱导分化为神经元样细胞,此神经元样细胞都能特异性地表达出NSE和NF,而不表达GFAP.经过定量计数分析发现用上述方法处理rMSCs 后出现NSE阳性的细胞约为75.5%±3.5%,出现NF阳性的细胞约为77.2%±2.8%.结论 rMSCs能在体外扩增、传代,并能被定向诱导分化为神经元样细胞.
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鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化
目的:分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化.方法:利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs.采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化.观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态.免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP染色呈阴性.诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性(P＜0.01).诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性.结论:鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化.
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骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化
目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymalstem cells, rMSCs)体外诱导分化成神经元的能力.方法:用0.25、0.5、1.0 mmol*L-1 IBMX诱导传代的rMSCs,待细胞分化后进行形态学观察,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定.结果:0.5 mmol*L-1 IBMX诱导细胞效果好,2 d即可见有神经元样细胞出现,6 d神经元样细胞占细胞总数的(23.2±2.3)%, NSE染色阳性.未分化细胞表达nestin,诱导3 d, 阳性细胞增多,6 d减少.结论:体外rMSC能扩增、传代,并被诱导分化成神经元样细胞.
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大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究
目的:探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)多向分化潜能.方法:从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代.通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定.通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定.在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b.结果:rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性.被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性.被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和 MAP-2a,b, 15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%.结论:体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中有前途的种子细胞之一.
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bFGF促增殖后骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元样细胞的分化
目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growthfactor,bFGF)体外作用于骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)后,诱导其向神经元样细胞和多巴胺能神经元样细胞定向分化的情况.方法从鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,用MTT法检测bFGF对骨髓MSCs生长的影响.10ng/ml bFGF作用2 d后,通过IBMX、细胞因子bFGF、GDNF、IL-1β、中脑神经胶质细胞条件培养基和中脑神经细胞膜碎片等分组联合诱导骨髓MSCs向神经元样细胞、多巴胺能神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法鉴定特异标志NSE、MAP-2a,b和TH的表达.结果在一定范围内,bFGF对骨髓MSCs具有明显的促增殖作用.分化的神经元样细胞表达NSE、MAP-2a,b和TH,联合应用GDNF、IL-1β、中脑条件培养基和中脑神经细胞膜碎片诱导7 d后,NSE阳性率为(27.774±2.747)%,MAP-2a,b为(28.006±3.080)%,TH为(3.098±0.352)%.结论体外骨髓MSCs被诱导分化成神经元样细胞和多巴胺能神经元样细胞,为帕金森等中枢神经系统疾病的细胞移植治疗奠定了基础.
关键词： 骨髓间充质干细胞 神经元样细胞 多巴胺能神经元样细胞 分化 -
银杏内酯B诱导骨髓间充质干细胞分化的神经样细胞的电生理及免疫学特征
目的 利用银杏内酯B(GB)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分化成熟,研究其分化的神经样细胞的电生理特征及免疫学特征.为临床治疗神经系统免疫性疾病提供合适种子细胞.方法 应用倒置相差显微镜对GB诱导的细胞进行多个时间点观察其细胞形态学改变,并对诱导后细胞进行免疫荧光染色;应用膜片钳技术,采取全细胞记录方式,对由GB诱导的大鼠BMSC进行诱导前及诱导后多个时间点的电生理测定.结果 免疫荧光染色阳性细胞:CHAT:(34.8％,n=12);GFAP:(31.6％,n=12);NSE:(21.3％,n=12);膜电位随着时间的变化:未分化细胞的峰值电流(1.45 ±0.15PA/PF,n=10),诱导后的神经元样细胞(2.18 ±0.14 PA/PF,n=12)变化显著(P＜0.05).结论 大鼠BMSC经过GB诱导后免疫特性及膜电位均发生改变,显示诱导后细胞有神经干细胞的免疫学特点,可以作为一种调节神经免疫力及修复力的种子细胞.
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银杏内酯B诱导大鼠骨髓间充质细胞分化为神经元样细胞的电生理研究
目的:研究银杏内酯B(GB)诱导大鼠骨髓间充质细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的电生理特性.方法:应用膜片钳技术,采用全细胞记录方式,对由GB谤导的大鼠MSCs进行诱导前后的电生理功能测定.结果:分化后的神经元样细胞较诱导前细胞的膜特性有了显著改变(P＜0.05).结论:大鼠MSCs经过GB诱导能够向功能性神经元方向分化.
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脐血间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的实验研究
目的:研究脐血间充质干细胞生物学特性及向神经元样细胞分化的潜能.方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,观察细胞生长情况,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标志物,分别向成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞进行诱导分化,通过茜素红染色、油红O染色检测脐血间充质干细胞成骨、成脂肪细胞诱导分化能力,而以免疫组织化学检测诱导后细胞表面神经标志物的表达.结果:纯化的脐血间充质干细胞贴壁生长,呈均一梭形,生长曲线呈S型,并以P3代增殖能力强,细胞表面不表达或弱表达CD34、CD35、CD106,高表达CD29、CD44、CD105.成骨诱导2周后,可检测到钙化基质的形成,成脂肪诱导3周后,可检测到脂滴的形成.向神经元样细胞诱导分化后,可观察到典型的神经元样形态改变,且NSE、NF、GFAP阳性表达.结论:分离纯化的脐血间充质干细胞具有较强的增殖能力与分化潜能,并在体外诱导条件下可以向神经元样细胞定向分化.
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枸杞多糖诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究
目的:探讨枸杞多糖诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可行性及其机制.方法:无菌条件下收集正常足月儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,用低糖DMEM培养基进行培养和纯化扩增.选取第3代细胞进行诱导实验,当传代细胞长满瓶底的80%以上时,先用含15%FBS和10ng/ml bFGF的DMEM完全培养基预诱导24小时,然后用不含血清含1g/L枸杞多糖的DMEM培养基诱导,光镜下观察细胞形态,用免疫组化技术检测细胞Nestin和NF的表达.结果:预诱导后MSCs没有变化,而经枸杞多糖诱导4h后细胞即出现形态学上的改变,细胞变成不规则形,立体感增强,从胞体伸出突起.免疫组化检测显示,细胞Nestin、NF呈阳性.结论:人脐血间充质干细胞经枸杞多糖诱导可转化为神经元样细胞,其诱导机制可能与枸杞多糖的抗氧化作用有关.
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大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元样细胞分化的实验研究
目的 研究大鼠骨髓问充质干细胞(BMSCs)离体分离和培养方法 ,探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)、神经营养因子(BDNF)在体外诱导BMSCs向神经元样细胞分化的作用.方法 采用出生3周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为三组:A组,bFGF+EGF+RA进行诱导分化;B组,BDNF+RA进行诱导分化;C组,RA诱导分化.在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫细胞化学技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单抗鉴定.结果 A组诱导5d后有大部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达.而B组可有部分NSE阳性细胞、C组细胞有少量NSE阳性细胞.结论 bFGF+EGF+RA、BDNF+RA和RA均可在诱导BMSCs向神经样元细胞分化,bFGF+EGF+RA组更优于和BDNF+RA组及RA组.
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小分子化合物诱导大鼠脂肪基质干细胞向神经元的分化
目的:探讨小分子化合物诱导大鼠脂肪基质干细胞(ADSCs)向神经元的分化.方法:用Trichostatin A(TSA)、RG-108、8-BrcAMP和Rolipram 4种小分子物质对SD大鼠的ADSCs进行诱导分化,用免疫荧光形态学、免疫印迹和qRT-PCR等方法分别检测诱导前、后ADSCs神经元标志的表达.结果:诱导7d时,ADSCs呈明显的神经元样结构,胞体呈圆形,具有多个突起,神经元样形态变化率高达95.12％±2.65％;诱导后的ADSCs nestin、β-tubulinⅢ、MAP2和ChAT在rnRNA和蛋白水平的表达均有升高.结论:小分子化合物可将ADSCs诱导分化为神经元样细胞,其可作为治疗神经系统疾病及损伤的干细胞移植的种子细胞.
