冠状病毒的生物学特性

冠状病毒属于巢状病毒目,冠状病毒科,冠状病毒属.成熟的冠状病毒直径约为60 nm～220 nm,电镜下呈日冕状或皇冠状,故命名为冠状病毒,分为3个抗原群:第Ⅰ群:猪传染性胃肠炎病毒、猪呼吸道冠状病毒、犬冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、猫肠炎冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、人冠状病毒229E(HCoV-229E);第Ⅱ群:大鼠冠状病毒、大鼠涎泪腺炎病毒、牛冠状病毒(BCV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒、兔肠炎冠状病毒、北海鸥病病毒;第Ⅲ群:鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、兔冠状病毒、猴冠状病毒、豹冠状病毒、火鸡冠状病毒、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43).

减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的鸡传染性支气管炎病毒s1基因DNA疫苗及其免疫效力研究

为研制鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗,构建和表达了运送鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌.首先将鸡传染性支气管炎病毒M41株的全长s1基因插入到嵌合CpG DNA的真核表达质粒pVAX1中,构建出重组真核表达质粒pVAX1-S1-CpG.然后将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建出运送DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207(pVAX1-S1-CpG).将重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)分别以1×109 CFU,5×109 CFU,1×1010 CFU的剂量滴鼻和口服接种4日龄雏鸡,2周内所有试验鸡均无任何不良反应,试验结果表明重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)具有良好的安全性.在免疫后35 d,商品鸡体重测定结果表明重组菌免疫不影响鸡体增重.以5×109 CFU重组菌滴鼻和口服两次接种4日龄商品代伊莎褐蛋鸡,二免3周后,血清抗体和小肠黏膜抗体测定结果表明,SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组抗体水平与空白对照组、空载体对照组之间分别存在极显著性差异(P＜0.01).攻毒试验结果表明,重组菌SL7207(pVAX1-S1-CpG)免疫组有较高的免疫保护效力,与灭活苗和减毒苗效力相当,显示出一定的应用前景.

几种鸡传染性支气管炎病毒活疫苗对中国流行毒株CK/CH/LDL/97I的保护作用评价

选择我国应用的五株鸡传染性支气管炎活疫苗毒株(JAAS、IBN、Jlin、J9和H120)和当地流行毒株(CK/CH/LDL/97 Ⅰ)作为研究对象,对其S1基因进行序列比对分析,结果表明疫苗株与流行毒株的核昔酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别不超过76.4%和78.7%.S1基因的核苷酸系统发育树显示,疫苗株与流行毒株分属不同进化群,亲缘关系较远,属于不同的基因型.用这五株活疫苗进行针对强毒株CK/CH/LDL/97Ⅰ株的免疫保护实验,可见临床发病率为30%～100%;攻毒5d后每组随机扑杀10只鸡,采集器官,应用RT-PCR法检测病毒,气管样品病毒检出率为50%～90%,肾脏样品病毒检出率为10%～30%.由此可见:我国目前使用的主要活疫苗对异种IBV分离株的感染不能提供完全的保护作用.

鸡传染性支气管炎病毒广西分离毒株抗原相关性的研究

本研究将26个传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)广西分离毒株以及参考株M41和常用疫苗株H120、Ma5和4/91共30个毒株,分别与根据这些毒株S1基因高变区Ⅰ的基因分型结果而选取的属于3个不同亚群的7个代表性分离毒株和常用疫苗株H120、Ma5和4/91制备的共10个单因子血清,在鸡胚气管环培养(TOC)上进行病毒中和试验,然后根据中和试验结果对1985～2008年间课题组所分离的26个IBV广西地方流行毒株与3个常用疫苗株H120、Ma5和4/91以及参考毒株M41的抗原相关性及其血清型进行分析.结果显示,30个试验的毒株分属7个不同的血清型,其中26个分离株有两个优势血清型(占总分离株的68％),分别是血清1型(包含13个毒株)和血清2型(包含5个毒株).此外,我们还将分离毒株的血清分型结果与重要抗原基因(包括S1、N、M和3'UTR)的分型结果之间的关系进行了比较,发现它们之间的分型结果不尽相同.研究结果表明,近年来广西存在多个血清型IBV的流行而且不同时期流行的优势血清型不同,分离毒株之间以及分离毒株与疫苗毒株之间的抗原相关性也存在着差异.

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA.参照IBV Beaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT-PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因.扩增产物经Bst YⅠ、HaeⅢ和PstⅠ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型.将IBV H株S1基因克隆于pGEM-T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1 611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97.39%和97.27%.将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ-A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS-PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测,证实了表达产物的抗原特异性.

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因的体外表达和纯化

鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定.方法 用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞.强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水.用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性.结果 经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBVSczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C 10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600.2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应.结论 成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料.

鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定.方法 利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体.对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析.结果 获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性.结论 制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具.

间接免疫荧光技术快速鉴别H5和H9亚型禽流感病毒

利用抗禽流感H5和H9亚型病毒(AIV-H5、AIV-H9)血凝素的特异性单抗建立了免疫荧光鉴别AIV-H9和AIV-H5的方法.研究表明,该方法特异性强,与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒和鹅腺病毒,鸡传染性支气管炎病毒等不出现交叉反应,仅与AIV-H9或AIV-H5反应;敏感性试验表明,用100TCID50感染成纤维细胞系DF1细胞,在24h内就可以鉴别出AIV-H5和AIV-H9;对人工感染鸡的泄殖腔和病变组织用IFA方法和鸡胚接种同时进行检测比较试验,结果表明:IFA方法在24h可以鉴别出AIV-H5和AIV-H9,检出时间小于鸡胚死亡时间,且IFA检测的结果与鸡胚病毒分离,血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)的结果完全一致,同时其灵敏性优于HA和HI试验.这些结果表明该方法对于快速鉴别AIV-H5和AIV-H9具有良好的应用前景.

鸡传染性支气管炎病毒的RNA干扰

为探讨短的双链RNA(siRNA)对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)增殖的干扰作用,利用软件设计siRNA 1280个,75%位于Pol基因内.通过同源比较和保守性分析,筛选到针对Pol、M、N基因的12个siRNA(每个基因3～4个)作为后选目的片段,分别在Vero细胞、9日龄SPF鸡胚上进行基因干扰试验.结果,来自Pol、N靶序列的2个siRNA在Vero细胞上及鸡胚上均对IBV增殖产生明显的干扰作用,并与siRNA剂量有一定相关性,依赖于与mRNA互补的负链siRNA存在.本研究首次证实IBV增殖过程中存在siRNA干扰现象,为利用RNA干扰(RNAi)技术控制IBV提供了新手段.

鸡传染性支气管炎病毒变异株的分离及其S1基因序列分析

本实验对山东省泰安地区某蛋鸡场产蛋下降鸡群发生的临床症状疑似鸡传染性支气管炎病例,无菌采集气管、肺脏、肾脏等组织,接种SPF鸡胚,经病毒形态观察、血凝特性试验、动物回归试验等证实,我们鉴定到一株鸡传染性支气管炎病毒(IBV);病毒中和试验表明,该病毒为一株变异毒株,使用国外针对IBV 793/B血清型发表的血清型特异性引物经RT-PCR方法获得了该毒株的免疫原基因S1基因,初步确定该传染性支气管炎病毒变异毒株为793/B血清型.

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白基因的RT-PCR/RFLP分型

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属,可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变.近年来,由于新的IBV变异毒株不断出现,从而导致鸡传染性支气管炎病的不断爆发,造成严重的经济损失[1].IBV的基因组为单股RNA,约27.6kb,该基因主要编码3种主要结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N),其中S蛋白成熟裂解为S1和S2两个蛋白亚基.S1蛋白是IBV的主要免疫原基因,可刺激机体产生中和抗体,决定病毒的组织亲嗜性,在病毒血清学分类中起主要作用[1,2].H株是1993年在河南省分离的典型肾病变IBV毒株,我们对IBV的H株S1基因进行了RT-PCR及酶切分析,并将其PCR产物克隆入质粒载体,为进一步研究IBV的H株分子生物学特性和研制IBV基因工程疫苗打下基础.