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丹参提取物对血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大的影响
目的:研究丹参提取物对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌肥大及相关基因表达的影响,并探讨其抑制心肌肥大的作用机制.方法:乳鼠心肌细胞原代培养,复制AngⅡ致心肌细胞肥大模型,随机分为模型组(10-6g·L-1 AngⅡ),缬沙坦(10-4,10-3,10-2g·L-1Val)对照组,丹参提取物10-4,10-3,10-2g·L-1组的丹参提取物.BI-2000医学图像分析系统进行心肌细胞计数和直径测定,Bradford法测定心肌细胞蛋白质含量,反转录PCR(RT-PCR)法测定蛋白激酶D1 (PKD1) mRNA的表达.结果:与正常对照组相比,模型组心肌细胞数量上变化不大,心肌细胞直径、总蛋白质含量及PKD1 mRNA的表达明显增加(P＜0.05)；和模型组相比,Val对照组心肌细胞直径、总蛋白质含量及PKD1 mRNA的表达明显降低(P＜0.05)；而丹参提取物中、高剂量组心肌细胞直径、总蛋白质含量及PKD1 mRNA的表达均明显降低(P＜0.05).结论:丹参提取物能显著抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,可能与对PKD1 mRNA的表达调控密切相关.
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甲状腺激素促进肿瘤细胞增殖及血管新生信号通路的研究
目的 探讨甲状腺激素促进肿瘤细胞增殖及血管新生的信号通路.方法 体外培养人胶质母细胞瘤细胞系(SNB19),给予甲状腺激素(主要为T4,100 nmol/L)、四碘甲腺乙酸(tetraiodothyroacetic acid,Tetrac,100 nmol/L)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂(2.5 μmol/L)作用后,采用Western印迹方法检测磷酸化蛋白激酶D1(PKD1)、磷酸化组蛋白去乙酰化酶(HDAC)5、磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)1/2的表达,ELISA方法检测细胞培养上清血管内皮生长因子(VEGF)的表达量,3-(4,5)-2-唑噻-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖.结果 与对照组相比,T4干预组磷酸化PKD1、磷酸化HDAC5、磷酸化ERK1/2水平均增加(P均＜0.05),Tetrac干预组及PKC抑制剂干预组磷酸化PKD1、磷酸化HDAC5、磷酸化ERK1/2水平均降低(P均＜0.05).ELISA结果显示,与对照组相比,T4干预组VEGF浓度升高[(56.763±2.611) ng/L vs.(36.597±0.933) ng/L,P＜0.05],Tetrac+T4干预组VEGF浓度降低[(22.215±1.531) ng/L vs.(36.597±0.933) ng/L,P＜0.05].MTT结果显示,与对照组相比,T4干预组OD值较高[(0.333±0.020)vs.(0.243±0.006),P＜0.05],Tetrac干预组OD值较低[(0.060±0.016) vs.(0.243±0.006),P＜0.05].结论 甲状腺激素通过结合整合素αvβ3,激活ERK1/2信号通路促进肿瘤细胞增殖,激活PKC/PKD1/HDAC5信号通路促进血管新生.
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活性维生素D3对大鼠肺纤维化中蛋白激酶D1介导的抗氧化通路的影响
目的:探讨肺纤维化发生发展中蛋白激酶D1 (PKD1)介导的线粒体抗氧化通路的作用以及活性维生素D3在纤维化过程中对该通路的影响.方法:雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和治疗组.应用实时荧光定量PCR和免疫组织化学分别从mRNA和蛋白质水平检测大鼠肺组织中PKD1、核转录因子(NF-κB)和锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的表达.结果:在第14天,治疗组和模型组中PKD1、NF-κB和MnSOD的表达量都显著低于对照组,而治疗组中3种因子的表达量又明显高于模型组;在第21天,3种因子在模型组和治疗组中的表达量明显高于对照组.在第28天,3种因子在模型组和治疗组中的表达量与对照组相比两两之间均没有差异.结论:PKD1-MnSOD线粒体抗氧化通路在博莱霉素引起的大鼠肺纤维化早期发挥重要作用,活性维生素D3能够上调这一抗氧化通路,具有一定的抗氧化作用,对大鼠肺纤维化的发生发展具有一定的抑制作用.
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蛋白激酶D1及其磷酸化位点在皮肤鳞状细胞癌、Bowen病及光线性角化病组织中的表达
目的 探讨蛋白激酶DI(PKD1)及其磷酸化位点pPKD1-tyr463和pPKD1-ser916在鳞状细胞癌(SCC)、Bowen病和光线性角化病(AK)中的表达及意义.方法 收集新鲜SCC、Bowen病、AK及正常皮肤组织各10份,RT-PCR法检测各组样本中PKD1在基因水平的表达,Western印迹法检测各组样本中PKD1及其磷酸化位点在蛋白水平的表达.另收集蜡块组织SCC 50份、Bowen病20份、AK 20份及正常表皮组织10份,免疫组化检测PKD1、pPKD1-tyr463及pPKD1-ser916的表达情况.结果 正常皮肤组织、SCC、Bowen病和AK组织中PRKD1 mRNA的表达量分别为0.64±0.09、5.37±1.06、2.69±0.72和2.43±0.46,4组间差异有统计学意义(F=21.37,P＜0.05),且SCC、Bowen病和AK组织的表达水平均显著高于正常组织(P＜0.05),SCC组织又显著高于AK和Bowen病组织(均P＜ 0.05),而Bowen病与AK组织的表达量差异无统计学意义(P＞0.05).PKD1总蛋白及pPKD1-tyr463在SCC和Bowen病组织中主要表达在棘层细胞及异形细胞的细胞质和细胞膜,且阳性表达率均显著高于正常皮肤组和AK组(均P＜0.01);pPKD1-ser916仅在部分高分化SCC癌巢中少量表达,而低分化鳞癌、AK、Bowen病及正常皮肤组织中均未见表达;SCC组中PKD1阳性表达率随鳞癌病理分级的提高而增加,且PKD1与pPKD1-tyr463的表达呈正相关(rcc=0.479,P＜0.05).Western印迹检测结果与免疫组化检测结果大致相符.结论 PKD1及其磷酸化位点Tyr463可能参与复层鳞状上皮来源的皮肤肿瘤的形成和进一步发展分化,在皮肤SCC形成进程中PKD1可能通过Tyr463位点活化而发挥促进作用.
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子宫内膜癌中PKD1的表达及其临床意义
目的 探讨蛋白激酶D1(protein kinase D1,PKD1)在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中的表达,并分析其与子宫内膜癌临床病理特征的关系.方法 应用免疫组化SP法及qRT-PCR法检测92例子宫内膜癌组织和48例正常子宫内膜组织中PKD1 mRNA及其蛋白的表达,分析PKD1在子宫内膜癌组织中的表达及其与分化程度、临床分期的关系.应用Westernblot法检测PKD1蛋白在正常子宫内膜细胞株及不同分化程度的子宫内膜癌细胞株中的表达水平.结果 子宫内膜癌组织中的PKD1 mRNA及蛋白表达水平均显著高于正常子宫内膜组织(P＜0.01);PKD1 mRNA及蛋白表达与子宫内膜癌的组织分化程度均有相关性,且组织分化程度越低,临床病理分期越高,PKD1的表达越丰富.PKD1蛋白在子宫内膜癌细胞株中的表达水平也远高于正常子宫内膜细胞中的表达(P＜0.01),且癌细胞株的分化水平越低,PKD1蛋白表达的水平越高.结论 PKD1在子宫内膜癌患者癌灶中呈高表达,PKD1表达水平的高、低可以做为预测子宫内膜癌恶性程度的一项重要参考依据.
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PKD1与PKD3基因在小鼠胚胎发育早期心脏组织中的表达及意义
目的:探讨蛋白激酶D1(protein kinase D1,PKD1)与蛋白激酶D3(protein kinase D3,PKD3)基因在小鼠胚胎发育早期心脏组织中的表达及意义.方法:构建PKD1与PKD3双敲除基因小鼠模型,RNA原位杂交实验检测PKD1与PKD3在胚胎发育E9.5与E10.5 d时心脏中的分布情况,Western blot检测PKD1与PKD3蛋白的表达,体视显微镜及HE染色观察心脏的形态学及组织学.结果:E9.5 d时,PKD1与PKD3在心脏流出道、右心房、右心室等位置均可见表达.在E10.5 d,PKD1与PKD3在右心房均高表达,在流出道也可见表达.在E9.5 d时,PKD1与PKD3在心脏的外型上没有明显差异;在E10.5 d时,所有双敲除小鼠都有明显的胸腔积水与心腔扩大的表型,心壁很薄;从E12.5 d开始就见不到双敲除小鼠.E8.5 d与E9.5 d时,双敲除小鼠的基因型分布符合孟德尔定律.结论:PKD1和PKD3均参与小鼠胚胎的心脏发育,但是其具体作用机制及相互之间的关系仍需进一步研究.
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蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性内皮祖细胞中的促血管新生作用
目的：探讨蛋白激酶 D1（PKD1）对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）黏附、迁移、增殖、血管形成能力及内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表达的影响。方法体外培养、分离和鉴定大鼠骨髓源性 EPCs，观察 PKD1及其特异性阻断剂CID755673对 EPCs 的黏附、迁移、增殖、血管形成能力的影响，以及对 EPCs 中 eNOS 的 mRNA 表达和蛋白表达的影响。结果 EPCs 体外细胞培养实验表明，PKD1可明显促进EPCs 的黏附、迁移和增殖，提升 EPCs 的血管形成能力，上调EPCs 中 eNOS 的 mRNA 表达和蛋白表达水平。结论PKD1具有调控 EPCs 促血管新生的作用，其促血管新生的作用可能以一种依赖 eNOS 的方式进行。
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皮肤病中蛋白激酶D1研究进展
蛋白激酶D1是一种在体内多个重要器官广泛表达的钙离子/钙调蛋白依赖性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与多种重要的生理和病理活动,在许多肿瘤组织中表达异常.PKD1促进角质形成细胞增殖,抑制其分化,对表皮伤口愈合及肿瘤的形成具有促进作用,与UVB、ROS等影响皮肤疾病发生发展的重要因素之间都有密切联系.因此PKD1可能成为治疗某些皮肤病甚至皮肤肿瘤更有效的分子靶点.
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探讨靶向调控蛋白激酶D1的微小RNA及其对大鼠急性胰腺炎的影响
目的 预测和印证调控蛋白激酶D1(PKD1)的微小RNA(miRNA),探讨其在蛙皮素诱导的大鼠急性胰腺炎(AP)中发挥的作用.方法 生物信息学软件预测PKD1的上游调控miRNA,并通过双荧光素酶报告基因和Western blot验证目标miRNA对PKD1表达的调控.采用蛙皮素(20μg/kg)腹腔注射(每隔1 h注射1次,连续6次)的方法构建AP模型.大鼠分为正常组(10只)、AP组(20只)和治疗组(20只),其中,正常组不做处理,AP组和治疗组分别在造模前腹腔注射对照miRNA和带CY5荧光基因的miRNA模拟体.AP组和治疗组各取10只在首次注射蛙皮素后6 h处死,其余在首次注射后24 h处死.所有动物下腔静脉采血检测血清淀粉酶、脂肪酶活力;采集胰腺组织包埋切片行免疫组织化学染色检测PKD1的表达,HE染色进行AP病理评分.结果 TargetSacn7.1软件预测miR-128-3p为PKD1潜在的调控miRNA,双荧光素酶报告基因和Western blot证实miR-128-3p与PRKD1 mRNA 3′UTR结合,抑制PKD1的蛋白表达.造模后6 h,AP组与治疗组血清淀粉酶和脂肪酶活力较正常组增高[13313.00(9424.00～15995.00)U/L、13552.00(10399.50～18408.25)U/L比1430.50(1214.25～1543.25)U/L;547.00(515.00～627.00)U/L、857.50(522.00～1222.25)U/L比34.00(32.50～34.75)U/L],差异均有统计学意义(χ2=8.715,P<0.05;χ2=9.115,P<0.05),提示造模成功.造模后24 h,治疗组PKD1免疫组织化学评分[0.50(0～2.75)分]较正常组[4.00(4.00～8.00)分]和AP组[4.00(3.75～8.00)分]均下降,差异有统计学意义(χ2=18.302,P<0.05).炎性细胞浸润和组织坏死明显好转,病理评分总分显著低于AP组(3.80±0.85比6.90±1.15,t=4.481,P<0.01).结论 miR-128-3p是PKD1的上游调控miRNA,可抑制PKD1介导的AP大鼠的组织坏死和炎性细胞浸润.
关键词： 急性胰腺炎 miR-128-3p 蛋白激酶D1 坏死 -
黄芪提取物对血管紧张素Ⅱ致培养乳鼠心肌细胞肥大的影响
目的 研究黄芪提取物对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌细胞肥大的影响及蛋白激酶D1(PKD1)基因转录表达的影响.方法 乳鼠心肌细胞原代培养,复制AngⅡ致心肌细胞肥大模型后,随机分为正常对照组、模型组、缬沙坦(Val)对照组、黄芪提取物3个不同剂量组.正常对照组不加入任何药物；模型组加入终浓度为10-6g·L-1AngⅡ；Val组在模型组的基础上加入终浓度为10-6g·L-1的Val；黄芪提取物组在模型组的基础上加入低、中、高剂量(10-4,10-3,10-2g·L-1)的黄芪提取物.光镜下进行心肌细胞计数和直径测定,Bradford法测定心肌细胞蛋白质含量,反转录PCR(RT-PCR)法测定PKD1 mRNA的表达.结果 和正常对照组相比,模型组心肌细胞数量上变化不大,心肌细胞直径、总蛋白质含量及PKD1 mRNA表达明显增加(P＜0.05)；和模型组相比,Val组及黄芪提取物中、高剂量组心肌细胞直径、总蛋白质含量及PKD1 mRNA表达均明显降低(P＜0.05).结论 黄芪提取物可能通过下调PKD1 mRNA的表达而显著抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大.
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蛋白激酶D1甲基化对胃癌细胞株BGC-823增殖侵袭的影响
目的:检测蛋白激酶D1(PKD1)在胃癌细胞中的表达,并探讨其对胃癌细胞增殖侵袭的影响.方法:体外培养胃癌细胞系BGC-823,使用PKD1甲基化特异性阻断剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理胃癌细胞,Western Blot法检测胃癌细胞中PKDI蛋白的表达情况,MTT法检测胃癌细胞的增殖,Transwell实验检测胃癌细胞的侵袭力.结果:5-Aza-CdR作用后,胃癌细胞中PKDI蛋白表达明显增加(P<0.05),细胞增殖速度减慢,侵袭能力减弱(P<0.05).结论:胃癌细胞中PKD1表达的下调在胃癌的发病过程中可能起重要作用,并可能与胃癌细胞增殖侵袭能力改变有关.
关键词： 蛋白激酶D1 5-杂氮-2'-脱氧胞苷 BGC-823 -
黄芪提取物对乳鼠肥大心肌细胞PKD1 mRNA表达的影响
目的 探讨黄芪提取物对乳鼠肥大心肌细胞中蛋白激酶D1(PKD1)mRNA转录表达的影响及其作用机制.方法 乳鼠心肌细胞原代培养,复制AngⅡ致心肌细胞肥大模型后,分别从不同剂量和不同处理时间研究黄芪提取物对乳鼠肥大心肌细胞PKD1 mRNA表达的影响.不同剂量组随机分为正常对照组、模型组、缬沙坦(Val)对照组及黄芪提取物组.正常对照组不加入任何药物；模型组加入终浓度为10-6 g/L AngⅡ；Val组在模型组的基础上加入终浓度为10-6 g/L的Val;黄芪提取物组在模型组的基础上加入10-4、5× 10-4、10-3和2×10-3 g/L不同浓度的黄芪提取物.不同处理时间组随机分为正常对照组、模型组、Val组、10-3g/L剂量黄芪提取物组；收集心肌细胞的不同时间点分别为24、48、72和96 h.应用RT-PCR法测定PKD1的mRNA表达.结果 黄芪提取物不同剂量组对乳鼠肥大心肌细胞PKD1 mRNA表达的影响结果表明,与模型组相比,Val组PKD1 mRNA的表达显著降低(P＜0.05)；黄芪提取物5×10-4、10-3和2×10-3 g/L剂量干预组PKD1 mRNA的表达显著降低(P＜0.05),且呈剂量依赖性趋势.黄芪提取物10-3 g/L及2×10-3 g/L剂量组和Val组相比,其对PKD1 mRNA的表达抑制效果基本相当.而黄芪提取物不同作用时间对乳鼠肥大心肌细胞PKD1 mRNA表达的影响结果表明,和模型组相比,24、48、72和96 h不同处理时间的Val组及黄芪提取物组心肌细胞PKD1的mRNA表达均显著降低(P＜0.05),且黄芪提取物组心肌细胞PKD1 mRNA的表达呈时间依赖性下降趋势；黄芪提取物72、96h处理组和同一时间点Val组相比,两者对PKD1 mRNA的表达抑制效果基本相当.结论 黄芪提取物可显著抑制AngⅡ诱导的肥大心肌细胞中PKD1 mRNA的表达,且呈时间和浓度依赖性,这可能为心肌梗死后心肌肥厚的逆转提供新的研究思路.
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大鼠肺纤维化和活性维生素D3干预后P32和PKD1的表达及作用研究
目的 探讨大鼠肺纤维化发生发展中透明质酸结合蛋白(P32)和蛋白激酶D1(PKD1)的表达及相互作用,以及活性维生素D3(VD3)干预后这2种因子表达的变化.方法 90只清洁级雄性SD大鼠随机分成3组:对照组、模型组和治疗组.模型组和治疗组通过气管内注射博来霉素(BLM,5 mg/kg)的方法复制大鼠肺纤维化模型,对照组经气管注射等体积的生理盐水(500μl/kg).术后第2天,治疗组腹腔注射VD3(2μg/kg),模型组腹腔注射等量的VD3的溶剂(99.9%丙二醇和0.1%乙醇),对照组腹腔注射等量的生理盐水,各组均注射1次/2 d.各组分别于术后第14、21、28天处死10只大鼠.通过检测大鼠肺组织羟脯氨酸含量来验证肺纤维化,应用实时聚合酶链反应(real-time PCR)和免疫组织化学技术分别检测大鼠肺组织中P32和PKD1的表达水平.结果 纤维化早期(14 d),治疗组中P32和PKD1 mRNA和蛋白质表达量与模型组比较,差异有统计学意义(P <0.05),治疗组均高于模型组;相关性分析发现这2种基因的mRNA和蛋白质表达量具有相关性.结论 在大鼠肺纤维化过程中,活性VD3可能在纤维化早期促进P32和PKD1的表达,通过P32和PKD1在线粒体内的相互作用来实现抗氧化作用,进而抑制肺纤维化的发生发展.
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蛋白激酶D1促血管新生的体内外实验分析
目的:探讨蛋白激酶D1(PKD1)促血管新生的作用,为心肌梗死等缺血性疾病以PKD1为治疗靶点提供新的思路.方法:体外培养、分离和鉴定内皮祖细胞(EPCs),观察PKD1及其特异性阻断剂CID755673对EPCs中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体KDR表达的影响.复制大鼠心肌梗死模型,分析PKD1及CID755673干预对大鼠心肌梗死后受损心肌组织病理形态学、微血管和内皮细胞变化以及VEGF、KDR表达的影响.结果:EPCs体外细胞培养实验表明,PKD1可明显上调EPCs中VEGF和KDR的表达水平.大鼠心肌梗死动物实验结果表明,PKD1干预后的大鼠心肌组织排列较为有序,结构较为清晰,内皮细胞胞膜光滑、完整,周细胞可见,心肌组织中的VEGF和KDR表达水平显著上调.结论:PKD1有明显的促血管新生作用,该作用可能是通过VEGF介导而实现的.
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蛋白激酶D1在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用
目的 研究蛋白激酶D1 (PKDl)在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用,为进一步探讨PKD1在烟曲霉感染引起的肺曲霉病中的作用及其机制奠定基础.方法 首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌细胞A549和HEK293细胞中,分别将灭活的烟曲霉分生孢子(1×105 CFU/ml)于不同时间处理上述两组细胞,Western blotting证实PKD1的过表达,并检测PKD1的磷酸化活性;其次在A549细胞中分别转染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以灭活的烟曲霉分生孢子处理细胞30 min,分别检测下游NF-κB通路相关信号分子的磷酸化活性;后,将NF-κB-1uc荧光素酶报告基因及内参照报告质粒海肾荧光素酶(pRL-SV40)共转染人表达GFP、GFP-PKDl的A549细胞中,两组细胞在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理24 h,收集细胞裂解液,进行双色荧光素酶活性检测.结果 Western blotting证实PKD1的过表达时间依赖性地增强烟曲霉刺激的A549细胞和HEK293细胞中PKD1的磷酸化活性及NF-κB通路中IKB和p65(pS276)的磷酸化活性,反之,敲低PKD1的表达则抑制烟曲霉介导的NF-κB通路中IKB和p65(pS276)的磷酸化活性.过表达PKD1明显增加NF-κB-luc荧光素酶的转录激活活性.结论 PKD1可能在烟曲霉刺激的NF-κB通路的激活及转录活性中起重要作用.
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骨形态发生蛋白7改善糖代谢的作用及其机制
目的 探索骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)对2型糖尿病小鼠糖代谢的影响及其机制.方法 将8周龄雄性C57BL/6小鼠,采用小剂量链脲佐菌素注射联合高脂喂养建立2型糖尿病小鼠模型.将建模成功的小鼠分为4组(n=20)∶2型糖尿病模型组,PBS对照组(PBS腹腔注射),BMP7低剂量组(BMP7,100 μg/kg,隔日腹腔注射),BMP7高剂量组(BMP7,200 μg/kg,隔日腹腔注射).4周后,分别检测血糖、血总胆固醇、甘油三酯、血清胰岛素水平、体质量的变化,并计算胰岛素分泌指数HOMA-β和胰岛素抵抗指数HOMA-IR.取小鼠胰腺,Western blot检测蛋白激酶D1(protein kinase D1,PKD1)及磷酸化PKD1的表达变化.结果 与2型糖尿病模型组和PBS对照组相比,BMP7高剂量组和低剂量组的血糖、甘油三酯均明显降低(P＜0.05),而血清胰岛素水平、HOMA-β均显著升高(P＜0.05).BMP7低剂量组和BMP7高剂量组的体质量均低于对照组(P＜0.05),BMP7高剂量组的HOMA-IR低于对照组(P＜0.05).Western blot检测发现BMP7处理组的PKD1蛋白表达量与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05),但磷酸化PKD1水平均明显升高(P＜0.05).结论 BMP7可以促进2型糖尿病小鼠的胰岛素分泌和改善其胰岛素敏感性,从而降低血糖,其改善胰岛素分泌作用可能与增加PKD1磷酸化有关.
