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内蒙古鼠疫耶尔森菌差异区段分型特征研究
目的 研究分离自内蒙古不同鼠疫疫源地、不同宿主和媒介的鼠疫耶尔森菌的差异区段基因型分布特征.方法 选取内蒙古3个鼠疫疫源地分离的鼠疫耶尔森菌307株,采用差异区段分析法,设计24对引物进行DFR位点扩增分型,用BioNumerics软件分析.结果 通过差异区段分型方法共发现13种基因型,其中5种基因型(Gnm1～Gnm5)为本研究首次报道.长爪沙鼠疫源地有9种基因型,主要基因型为G11(71.8％,122/170);达乌尔黄鼠疫源地有6种基因型,主要为G10(44.1％,41/93)和G11(35.5％,33/93);布氏田鼠疫源地有4种基因型,主要为G14(90.9％,40/44).3个疫源地均分布有G11型.结论 内蒙古鼠疫耶尔森菌差异区段基因型分布具有明显的地理分布特征,对分析内蒙古鼠疫的传播和遗传演变具有重要的分子流行病学意义.
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青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫疫源地鼠疫耶尔森菌遗传特征分析
目的 研究青藏高原喜马拉雅鼠疫疫源地那曲和比如地区鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)菌株的分子分型特征,确定具有该分型特征的鼠疫菌在青藏高原鼠疫疫源地的分布情况.方法 应用板块重排、差异区段分析、间区规律短回文重复、多位点可变数目串联重复序列分析方法对分离自青藏高原地区、四川省、云南省的98株鼠疫菌进行分析.结果 那曲和比如地区的鼠疫菌菌株中第57～60板块的排列方式与测序菌株Z176003一致,在其他实验菌株中未发现该重排特征.结论 分离自那曲和比如的鼠疫菌菌株具有独特的分子分型特征,该特征在本地区的菌株中普遍存在,且菌株多态性持续分化.
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小肠结肠炎耶尔森菌感染性疾病
耶尔森菌属对人类致病的包括三个种:鼠疫耶尔森菌、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌,其中小肠结肠炎耶尔森菌是一种很重要的人类肠道致病菌,世界各大洲均有发现,近年来逐渐受到全球重视.它引起的临床症状十分广泛,从中度腹泻到肠系膜淋巴结炎,对一些免疫功能异常的病人则会出现严重的并发症(败血症),在某些国家和地区(如芬兰),小肠结肠炎耶尔森菌是一种引起慢性无菌性关节炎的常见因子.
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制定来源于中国各类鼠疫自然疫源地鼠疫菌种的新编号方案的建议
目前,中国保存着来自全国各种类型的鼠疫自然疫源地,自1948年以来的各个流行时期的鼠疫菌的代表菌株,数量超过8000株以上,是世界上大的鼠疫菌种多样性资源.这一资源已经多次在中国鼠疫预防与控制的实践中发挥作用,是提高中国对鼠疫的认识,在防制能力和控制技术方面赶上世界水平的重要的条件.
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云南省鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列分析
目的 通过多位点可变数日串联重复序列分析(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)方法,对云南省鼠疫菌株进行基因分型.方法 采用聚合酶链反应(PCR)和毛细管电泳,通过BioNumerics软件进行处理,分析云南省158株鼠疫耶尔森菌基因型.结果 选取鼠疫菌的14个VNTR位点,5个VNTR位点对云南省鼠疫菌具有多态性分析意义,利用这5个位点对云南菌株进行分析,云南158株鼠疫菌可分为2个群,3个簇,5个基囚型,野鼠鼠疫菌属于A簇,丽江玉龙鼠疫菌属于B簇,家鼠鼠疫菌属于C簇,与传统的生态分型结果吻合.结论 本次试验筛选的5个位点可以用于云南省鼠疫菌的分型,云南家鼠鼠疫菌、野鼠鼠疫菌及玉龙鼠疫菌分属不同的基因簇,玉龙鼠疫菌与野鼠鼠疫菌同属一个群,聚类结果与实际的地理相关性很好.
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甘肃省202株鼠疫耶尔森菌基因型分布及流行特征分析
目的 研究甘肃省鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)基因分型分布及其流行特征.方法 根据鼠疫菌基因组23个差异区段设计引物,采用PCR技术,分析甘肃省202株不同来源的鼠疫菌.结果 202株鼠疫菌共分为8个基因型,即1b、5、7、8、13、26、GS1型(新基因型)和GS2型(新基因型).自20世纪60年代起至今分离到1b、8和GS1基因型,而自1977年后再未分离到7、13、26基因型,在1995年后才分离到GS2、5基因型.结论 甘肃省1b、8和GS1基因型鼠疫菌自20世纪60年代起持续流行至今,7、13和26基因型菌已有40余年未分离到,而GS2和5基因型菌自20世纪90年代才开始流行.
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基因和抗原检测技术在鼠疫监测中的应用与评价
目的 对鼠疫特异性基因和抗原检测新技术进行鼠疫监测现场的应用及评价.方法 检测来自鼠疫自然疫源地的各类标本中鼠疫菌DNA和F1抗原,采用多重PCR、胶体金免疫技术和酶联免疫吸附试验,与鼠疫菌培养和反向间接血凝试验进行平行对照.结果 使用5种方法平行检测鼠类、蚤类标本1798份,共判定鼠疫标本132份,总阳性率为7.34%;与单纯鼠疫菌培养阳性相比(113份,阳性率为6.28%),其中鼠疫菌培养与基因、抗原检测的总阳性率为7.34%,与单纯检菌阳性率比较检出率提高16 81%,符合率达到97.13%.结论 在鼠疫监测中增加基因与抗原联合检测,可以提高鼠疫的确诊率.
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云南省鼠疫耶尔森菌规律成簇间隔短回文重复序列分型
鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)基因组中包含3个规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)位点(YPa,YPb和YPc).本研究对云南省不同生态型鼠疫菌株的CRISPR序列进行分析,了解不同鼠疫疫源地及鼠疫菌株间的相互联系.1.材料与方法:(1)菌株来源及DNA制备:选取云南省171株鼠疫菌,其中剑川县野鼠菌株16株、玉龙县玉龙菌株7株、家鼠菌株148株.菌株保存于云南省地方病防治所.采用德国Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取鼠疫菌株DNA,置-20℃保存.
关键词： 鼠疫耶尔森菌 规律成簇间隔短回文重复序列 -
鼠疫耶尔森菌rRNA基因识别特征研究
目的 分析鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的rRNA基因识别特征.方法 通过比较基因组学方法,利用Clustal W软件,对目前已完成全基因组测序的9株鼠疫菌的rRNA基因序列进行分析,分别比对rRNA基因簇两侧的2000bp序列、基因簇内16S、23S、5S rRNA及16S～23S基因间隔区序列,以确定鼠疫菌rRNA基因的识别特征.结果 菌株D182038、D106004、Z176003和CO92分别有6个rRNA基因簇拷贝(6拷贝菌株),菌株91001、KIM、Nepa1516、Antiqua和Pestoides F分别有7个rRNA基因簇拷贝(7拷贝菌株).按照两侧2000bp序列不同,可将鼠疫菌rRNA基因簇分成13种类型,并可将6拷贝与7拷贝菌株进行区分;16S～23S rRNA基因间隔区含有4种不同种类和数量的tRNA基因,可将6拷贝菌株和7拷贝菌株分别进行区分;23S rRNA基因在不同菌株间及不同rRNA拷贝间的碱基突变数方差分析显示,各菌株间F=0.548,P=0.815>0.05;各拷贝间F=5.228,P<0.01.结论 鼠疫菌rRNA基因簇两侧序列、间隔区tRNA基因和23S rRNA基因可作为识别不同菌株和不同rRNA基因簇拷贝的指标,将鼠疫菌不同菌株进行分类.
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云南省鼠疫菌FseⅠ酶切分型及其流行病学意义
目的 构建云南省鼠疫菌Fse Ⅰ酶切的脉冲场凝胶电泳(PFGE)图谱库并探讨其流行病学意义.方法 采用限制性内切酶Fse Ⅰ对云南家、野鼠型及丽江玉龙鼠疫菌株进行酶切分析,并聚类分析电泳图谱.结果 30株被试菌株分为16种PFGE型别,其相似性系数为79.8％～100.0％; 16种PFGE基因型可以分为4个簇,除EV76自成一簇,其余3个簇分别为家鼠型基因簇、野鼠型基因簇及玉龙基因簇.结论 云南省鼠疫菌PFGE基因型与生态型、生物型相吻合,具有一定的区域聚集性,而丽江玉龙鼠疫菌为一个独立基因簇.
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鼠疫耶尔森菌caf1基因的克隆表达及其产物免疫学评价
目的 表达具有免疫学活性重组F1抗原(rF1),并以其构建检测鼠疫抗体胶体金试纸条.方法 将去掉信号肽编码序列的caf1基因片段与载体质粒pET32a(+)通过BamHI和Not I双酶切位点进行连接,将重组质粒[caf1-pET32a(+)]转化入BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经亲和层析纯化,以纯化rF1及天然F1抗原制备双检测鼠疫抗体胶体金标试纸条,并对浙江省528份人血清标本进行检测.结果含caf1-pET32a(+)的BL21(DE3),经诱导产生相对分子质量(M_r)约为35.5×10~3的rF1融合蛋白;rF1融合蛋白检测鼠疫抗体的敏感性等同甚至超越天然F1抗原;在528份人血清标本的检测中,rF1与天然F1的符合率为97.9%(K=0.466),有较好一致性.结论 制备的rF1,具有良好免疫学活性,该rF1可替代天然F1抗原,用于鼠疫免疫学检测.
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中国鼠疫耶尔森菌差异区段分型及其地理分布特征
目的 研究中国鼠疫耶尔森菌差异区段(DFR)分型及地理分布特征.方法 对分离自中国11个疫源地3 044株鼠疫菌,应用23个DFR和质粒验证(PMT1)PCR扩增,进行鼠疫菌DFR基因组分型及地理分布特征分析.结果 3 044株鼠疫菌共包括52个基因组型,其中19个为主要基因组型、33个为次要基因组型.在以往鉴定的31个基因组型基础上又增加了21个新基因组型.其中增加的3个新基因组型均为主要基因组型,即青藏高原喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地新增加32型、44型,内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫自然疫源地新增加50型.结论 在新增加的21个新基因组型中有3个为主要基因组型,中国鼠疫菌DFR主要基因组型具有明显的地理分布特征.
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鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌基因鉴别方法的建立及评价
目的 建立鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌基因鉴别方法.方法 依据鼠疫菌、假结核菌特有的基因组序列[“疫岛(PeI)”和“假岛(PsI)”],与已公布的12株鼠疫菌和4株假结核菌全基因序列进行比对,设计特异性的引物,对鼠疫菌、假结核菌和其他肠道细菌进行鉴定.结果 用52株鼠疫菌、57株假结核菌和其他肠道菌株进行验证,结果显示,5对鼠疫菌的鉴定引物中,2对(PeI2和PeI11)仅在52株鼠疫菌中扩出目的条带,另3对引物(PeI1、PeI3和PeI12)除鼠疫菌外在部分假结核菌株中也扩出目的条带;5对假结核菌鉴定引物中,1对引物(PsI1)在52株鼠疫菌和57株假结核菌株中扩出目的条带,4对引物(PsI7、PsI16、PsI18和PsI19)仅在57株假结核菌株中均扩出目的条带,在鼠疫菌中未扩出目的条带.结论 用鼠疫菌和假结核菌共有的PsI1序列、鼠疫菌特有的PeI2和PeI11序列及假结核菌特有的PsI7、PsI16、PsI18和PsI19序列组成的基因鉴别方法,可以用于鼠疫菌和假结核菌的基因快速鉴别.
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鼠疫菌pMT质粒的模块结构及其连接方式
鼠疫的致病菌鼠疫耶尔森菌有3个常见的质粒,编码一系列的毒力因子;其中大的质粒pMT编码F1抗原和鼠毒素,是鼠疫菌两个比较重要的毒力因子.
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鼠疫耶尔森菌质粒种类、功能及其流行病学意义
质粒是鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)染色体外的遗传物质,大多数鼠疫菌都带有3个质粒:pMT1 (pFra/pYT)、pCD1 (pYV)及pPCP1 (pPst/pPCY1/pPla/pYP)[1],是鼠疫菌毒力的重要组成部分,在抗吞噬及侵入扩散中扮演重要角色.除上述质粒外,国内外还陆续报道了一些其他质粒,这些质粒对鼠疫菌自身特性及遗传进化具有特殊的意义.本文就鼠疫菌质粒的种类、功能及其流行病学意义进行概述.
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青藏高原鼠疫耶尔森菌基因型分布
目的研究青藏高原鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)基因组型分布特征.方法对分离到的青藏高原鼠疫菌297株,根据已经证实的22个差异区段设计引物,每株鼠疫菌的每个基因差异区段都采用PCR技术进行验证.结果在喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地中,鼠疫菌基因组型有9种,分别为1、5、6、7、8、10、11、新基因组型和Ype-ancestor型,其中以5、8和10型为主,3种基因组型合计所占比例为80.6%(204/253),而且不同地区鼠疫菌基因组型的分布也不一致.青藏高原青海田鼠鼠疫疫源地鼠疫菌基因组型全部为14型.结论青藏高原鼠疫菌基因组型分布具有明显的地理特征.根据基因组型的分布状况推测出了鼠疫菌在青藏高原的传播路径.
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聚合酶链反应方法检测鼠疫耶尔森菌的内部对照研究
目的避免聚合酶链反应(PCR)方法检测鼠疫菌发生假阴性.方法通过克隆,将16SrRNA引物的扩增产物与鼠疫菌F1抗原基因克隆子相连,并以其作为内部对照模板进行PCR试验.结果得到了在包含F1抗原基因中连接有16S rRNA扩增产物的质粒,并初步确立了作为内部对照质粒的参照标准浓度.结论在采用PCR方法检测鼠疫菌时,加入适宜浓度的内部对照质粒作为模板与待检样品同时扩增,可避免假阴性的发生.
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鼠疫菌102 kb基因座一端IS100的缺失与pgm+稳定性的研究
目的了解鼠疫菌102 kb pgm基因座一端IS100的缺失与pgm+稳定性的关系.方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增国内各型鼠疫菌102 kb pgm基因座色素沉着这一端IS100的片段,并选择克隆测序分析.结果通过PCR扩增,其中只能扩增出约2560 bp左右条带的生态型,也就是其102 kb pgm基因座色素沉着这一端IS100的片段缺失,除锡林郭勒高原布氏田鼠型,还有北天山东段型、北天山西段A、B型,其pgm+表型非常稳定;而有一部分菌株的扩增结果为阴性另一部分菌株扩增出4492 bp条带的生态型,扩增出4492 bp条带的菌株102 kb pgm基因座色素沉着这一端有IS100,结果为阴性的菌株其整个102 kb pgm基因座可能已经丢失,此种情况包括祁连山型,青藏高原型,冈底斯山型,滇西纵谷型等,其pgm+表型表现出不稳定.结论鼠疫菌102 kb pgm基因座一侧缺失IS100的菌株,可具有较稳定的pgm+表型,而鼠疫菌102 kb pgm基因座两侧有IS100的菌株,pgm+表型不稳定.
关键词： 鼠疫耶尔森菌 102 kb pgm基因座 插入序列 -
应用TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术检测鼠疫耶尔森菌
目的发展一种快速、敏感、特异的检测鼠疫耶尔森菌方法.方法应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术,针对pMT1质粒上的caf1基因,pPCP1质粒上的pla基因,染色体上的与色素沉着相关的hms基因和侵袭素inv基因设计TaqMan引物探针,进行荧光定量PCR检验,评价方法的特异性、敏感性;构造并应用上述引物探针的外标对照定量;构造pla的内标对照,采用多重荧光定量PCR(FAM,VIC荧光检测),发现假阴性;采用UDG抗污染、ROX参照荧光染料矫正背景噪音,提高检验能力;检验模拟鼠疫耶尔森菌强毒株和EV菌感染的动物脾脏器样本,评价该法在实际工作的应用.结果设计的引物、探针特异性良好,pla、f1、hms指标的敏感性分别是低检出10拷贝、1拷贝、1拷贝.结论该方法能快速、灵敏、特异检出鼠疫耶尔森菌,对鼠疫监测、预防生物恐怖等方面具有重要意义.
关键词： 鼠疫耶尔森菌 实时荧光聚合酶链反应 定量分析 -
中国鼠疫耶尔森菌的分子生物学特征与遗传学意义
目的根据中国鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的分子生物学特征分析其遗传背景.方法利用实验研究中rRNA基因指纹图(ribotyping)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、随机扩增DNA多态性(RAPD)及插入序列(IS)等方面工作的原始数据,通过聚类分析等统计学手段,探究中国鼠疫菌株间的遗传学距离,分析各种方法作为鼠疫菌分子识别特征的意义.结果 rRNA基因指纹图型与脉冲场电泳型之间是相对应的,但同属于7拷贝rRNA基因的田鼠菌株与西藏仲巴菌株,其间的遗传学距离,却较6拷贝rRNA基因的菌株还远.而随机扩增型与rRNA基因型之间对应关系较不明确,有较多的例外情况.用相似值可以表示这些菌株之间的遗传距离.结论中国的鼠疫菌具有多种独特的分子生物学特征,其中新疆灰旱獭疫源地和西藏南部冈底斯山地理环境复杂,有较多的自然屏障,使鼠疫菌在流行过程中,限于局部地区,各自独立进化,产生了相互混合存在的多种基因类型.
