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16S rDNA序列在艾伯特埃希菌鉴定中的应用
目的 通过16S rRNA基因序列分析快速鉴定艾伯特埃希菌.方法 以30株疑似艾伯特埃希菌为材料,使用通用引物扩增其16S rRNA基因并进行测序.获得的序列与艾伯特埃希菌型菌株LMG 20976,基因组测序菌株KF1、NBRC107761、TW07627以及其他密切相关的细菌种(大肠埃希菌、赫曼埃希菌、费格森埃希菌、志贺菌和Shimwoellia blattae)的16S rRNA基因序列进行比较,并使用N-J法构建进化树来分析其相关性.结果 30株疑似艾伯特埃希菌的16S rRNA基因序列与艾伯特埃希菌参考菌株的序列相似性高,并与其聚类为一簇,为艾伯特埃希菌.结论 16SrRNA基因测序分析可用于艾伯特埃希菌的快速鉴定.
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基于16S rDNA数据库的细菌在线分类鉴定平台的构建
目的 利用且兼并简化现有16S rDNA基础数据库,建立可用于传染病预防控制及感染性疾病的临床诊疗的细菌快速分类的核糖体基因数据库,构建快速鉴定在线分析平台.方法 收集整理已有的包括RDP、GenBank、SILVA、HOMD等国际公认、公开的16S rDNA数据库,进行整理、筛选和去冗余,重新构建16S rDNA数据库.利用生物信息学构建自动化分析流程,并利用先进的web 2.0、JAVAEE等技术开发设计数据库系统及网站,构建了自动化的在线细菌分类鉴定平台.结果 通过核酸序列比较,将已公布的1 450 265条16S rDNA序列简化为具有代表性的96 138条序列,并构建了序列数据库.结合序列比较、序列聚类等生物信息方法,建立了基于web的快速检索系统(http://ssu.bioinfo-icdc.org).结论 通过构建基于16S rDNA序列的细菌分类鉴定在线分析平台,具有快速、简单、明确的特征,能够对病原菌进行快速、准确的分类学鉴定,有效提高传染病预防控制和感染性疾病临床诊疗中的病原菌鉴定和疫情溯源的速度,为及时实施有效治疗和控制措施赢得时间.
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16S rDNA序列分析法在国际船舶压载舱沉积物病原微生物检测中的应用
[目的]探讨16S rDNA序列分析法在国境口岸监测外来病原微生物的可行性.[方法]按照0.5mg/0.5ml样品接种10ml增菌液的比例将压载舱淤泥样品分别接种到营养肉汤和碱性蛋白胨水中,37℃过夜,震荡摇匀.增菌后划线接种在选择培养基上,过夜培养后挑取阳性菌落纯培养,按照试剂盒说明提取细菌基因组,扩增细菌基因组16S rDNA片段,将扩增产物纯化后进行序列分析.[结果]从48份样品中共检测12种细菌,其中检测到的霍乱弧菌有1株为B33株.这株霍乱弧菌早在2004年分离自非洲东南部国家莫桑比克的贝拉港,是O1群霍乱弧菌的经典型与Eltor型杂交后产生的菌株,O139群霍乱弧菌尚未检测到.[结论]16S rDNA序列分析法可用作国境口岸外来微生物的监测和分析.
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食源性金黄色葡萄球菌青霉素类药物耐药基因型的分析
目的 建立多重PCR方法检测青霉素酶基因和mecA基因,了解食源性金黄色葡萄球菌两种β-内酰胺类药物耐药基因的分布情况,为金黄色葡萄球菌引起食源性疾病的防治提供参考数据.方法 建立多重PCR技术检测金黄色葡萄球菌青霉素酶基因、mecA基因和16S rDNA；多重PCR方法测定食品来源的171株金黄色葡萄球菌对青霉素类药物的耐药基因型.结果 165株菌携带有青霉素酶基因(96.5％),9株菌携带有mecA基因(5.3％).结论 建立的多重PCR检测方法快速、简便、准确,可满足高通量筛选菌株的需求；食源性金黄色葡萄球菌具有很高的青霉素酶基因携带率,并存在耐甲氧西林的菌株.
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布鲁菌16S rDNA基因遗传分析
目的 通过分析临床分离的布鲁菌、其他盐杆菌科细菌以及临床常见致病菌的16S rDNA基因片段的差异并构建16S rDNA系统发育树,为进一步研究布鲁菌打下基础.方法 PCR扩增临床分离株的16SrDNA并测序；从EMBL下载常见盐杆菌科细菌和临床上常见致病菌的16S rDNA序列.利用CLUSTALX和MEGA程序进行16S rDNA比对并构建系统发育树.结果 成功扩增了临床分离菌株的16S rDNA,得到测序结果,比对临床分离菌株和相关菌株后,发现了特异序列5’-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3';系统发育树表明不同种的布鲁菌间的距离非常接近；布鲁菌和醋菌属的进化距离较近,但是和其他的盐杆菌的进化距离较远.结论 在布鲁菌16S rDNA中存在特异序列5'-ATCCCGGTCGCGGTTAGTGG-3’,有可能作为探针来快速检测布鲁氏菌.
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黄芪多糖对肥胖小鼠的减肥作用与调节肠道菌群的关系研究
目的：观察黄芪多糖（ Astragalus Polysaccharides ，APS）对于高脂饮食诱导的肥胖小鼠的减肥作用与调节肠道菌群的关系。方法：1）将50只C57bl／6J小鼠随机分为5组（n＝10），分别为正常对照组（Con）、HFD（high-fat diet）组和APS低中高（在高脂饮食中添加分别添加2％，4％，或8％的APS）剂量组。利用高脂饮食连续喂养8周诱导出小鼠肥胖模型，给药组同步喂养，每周进行称重。实验周期结束后，收集各组粪便样本，利用基于细菌16S rDNA测序的元基因组学方法，分析了APS对于高脂喂养小鼠肠道菌的影响。2）将10只C57bl／6J小鼠随机分为2组（n＝5），分别为HFD＿R组（HFD＿Recep-tor）和APS＿R组（APS＿Receptor），每天分别灌胃来自HFD组和APS低剂量组（2％APS）小鼠的新鲜粪便提取液进行肠道菌移植，前八周给予正常饮食，后四周更换为HFD。结果：APS能够明显抑制高脂喂养小鼠肥胖的形成、减轻肝脏脂肪变性、降低肝脏TG水平、改善胰岛素敏感性、显著恢复高脂喂养小鼠的肠道菌群紊乱，增加拟杆菌（ Bacteroidetes）与厚壁门（ Firmicutes）菌的相对丰度、降低变形菌门（ Proteobacteria）细菌的相对丰度，并且，APS的减肥效应能够通过肠道菌移植转移给高脂喂养受体小鼠。结论：APS对高脂喂养小鼠具有减肥作用，且APS的减肥作用与调节肥胖小鼠的肠道菌群有关。
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栽培苍术根际土壤微生物变化
目的:观察苍术栽培中根际土壤微生物数量和群落结构的变化规律.方法:稀释平板法测定一至二年生栽培苍术根际区土壤微生物群落细菌、真菌、放线菌总量;提取苍术根际区土壤微生物DNA,使用E. coli的27f和1 492 r引物扩增16S rDNA,Hinf内切酶酶切,比较一至二年生栽培苍术根际区土壤微生物群落结构的变化.结果:二年生苍术根际区土壤中细菌、真菌、放线菌普遍低于一年生样品,三者分别下降46.14%,49.25%,31.88%,土壤细菌、真菌及放线菌三者的比例改变;所有一至二年生的8个样品扩增后均得到重复性好且稳定清晰的16S rDNA条带,片段长度约为1 500 bp.Hinf酶切后多数样品在1 000 bp附近均出现主带,其他弱带不完全相同.就多数样品而言,一年生与二年生苍术根际区土壤样品的酶切谱带在年间变异大于年内的变异.结论:多年栽培苍术病虫害的发生,可能与其根际区土壤微生物数量和群落结构的改变有关.
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不同种植年限黄连根系土壤细菌PCR-DGGE分析
该研究应用PCR-DGGE技术,分析了不同种植年限正常生长、发病的黄连Coptis chinensis的根际和非根际土壤的细菌种群多样性指数,并选取代表性DGGE条带进行克隆测序,构建细菌系统发育树状图.结果表明,正常土样与发病土样土壤细菌种群差异明显,且发病土样多样性指数(H)高于正常土样;代表性条带克隆测序结果表明,黄连种植土壤中未培养细菌为优势菌群,其余类群为食酸菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、未培养克吕沃尔菌属以及未培养丛毛单胞菌,未发现已报道的植物病原细菌.发病土样中Clone band d的谱带亮度高于正常土样,该条带菌株在分类上属于食酸菌属.显然,黄连种植过程中,根际土壤中细菌种群发生了改变,其中食酸菌属的细菌在发病根际土壤增加,很可能与黄连病害发生有关.
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基于细胞色素C氧化酶基因(COI)和核糖体16S rDNA条形码的中药海蛇品种鉴定
海蛇是我国名贵药材之一,新鲜捕捞的海蛇不易保存,一般立刻晒制保存,晒干后海蛇外观变化大,不宜再用外观鉴定,而基因条形码作为一种较新的分子鉴定方法则不再受外观变化困扰,适用于海蛇晒干制品的品种鉴定.该以平颌海蛇Lapemis hardwickii、环纹海蛇Hydrophis fasciatus、尖尾海蛇Aipysurus eydouxii、贝尔切海蛇 H.belcheri和兰伯特海蛇H.lamberti等5种海蛇为研究对象,通过提取实验和基因测序技术测定了这5种海蛇的COI和16S rDNA基因序列,对这些序列进行互相比对并用相似性搜索算法评价5条序列的鉴定成功率.研究显示,16S rDNA基因条形码能初步区分海蛇种属,COI基因条形码序列种内种间差异明显,能进一步区分海蛇品种.因此表明COI序列可以作为海蛇晒干制品的品种鉴定方法.
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新疆维吾尔族长寿老人肠道菌群多样性分析
目的 分析新疆维吾尔族长寿老人肠道菌群多样性,比较肠道微生物种群的差异,以求找到肠内某些与健康有重要关系的有益菌. 方法 采用不依赖分离培养的16S rDNA的PCR-DGGE基因指纹技术,对新疆维吾尔族长寿老人肠道细菌进行检测. 结果 13份粪便标本肠道菌群总DNA均扩增出16S rDNA,大小约470 bp;DGGE显示每种样品条带数目、亮度及位置不同,聚类分析显示不同个体粪便标本的细菌组成差异性非常大. 结论 新疆维吾尔族长寿老人肠道菌群具有多样性.基于16S rDNA的PCR-DGGE基因指纹分析可揭示肠道细菌组成的差异.
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内蒙古地区乳源性金黄色葡萄球菌的分离与分子鉴定
目的 对从内蒙古通辽市地区患乳腺炎奶牛乳中分离到的1株疑似金黄色葡萄球菌进行分子鉴定, 并建立一种能直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR方法.方法 采集疑似金黄色葡萄球菌感染乳腺炎奶牛乳液标本, 进行细菌的分离培养, 革兰染色、镜检、生化特征鉴定, 溶血及药敏试验, 并进行16SrDNA序列扩增、测序分析、分子鉴定, 采取扩增序列NCBI Blast比对方法建立进化树进行分子进化分析.结果 该分离株菌为革兰染色阳性, 菌落形态、菌体形态、培养特性与分子特征均与金黄色葡萄球菌相符.PCR扩增出金黄色葡萄球菌16SrDNA序列, 长度为611bp, 该序列与GenBank公布的葡萄球菌 (KY784112.1) 16SrDNA序列相似性为100％, 进化树分析该分离株与KY784112.1金黄色葡萄球菌属于近缘发育分枝.结论 分离菌株为乳源性金黄色葡萄球菌, 采用PCR法可作出快速检测.
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美洲大蠊肠道内生戈登放线菌的分离与鉴定
目的 从美洲大蠊肠道内分离戈登菌,对其进行分类鉴定和系统发育学分析.方法 室外捕获美洲大蠊样品,体表消毒后,用手术刀从侧面将其腹部切开,取出肠道,匀浆至所需浓度(10、0.005、0.002 5 μg/ml),吸取悬浮液0.1 ml于平板上,28℃培养至少1周,分离美洲大蠊肠道内的戈登菌.通过分离菌株形态观察和16S rDNA序列分析分类鉴定,运用Mega 5.1软件,利用大似然值法,构建系统发育树.结果 从美洲大蠊肠道分离出戈登菌6株.菌株革兰染色呈阳性,菌落较小,呈橘红色,颗粒状,表面稍微湿润,产橘红色色素.菌体呈短棒状,菌丝呈直杆状或螺旋状,无横隔,符合戈登菌的基本特征.16S rDNA基因扩增后,测序结果表明,所分离菌株均为戈登菌.系统发育树分析表明,所分离菌株与分离自土壤、植物和海洋中的戈登菌亲缘关系较近.结论 首次从美洲大蠊肠道内分离到戈登菌,为进一步研究美洲大蠊内生戈登菌的作用奠定基础.
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分子生物学方法鉴定由自毙鼠分离的细菌
目的 对1株由自毙鼠分离的细菌(X175菌株)进行属、种及型的鉴定.方法 ①采用16S rDNA对X175菌株进行种属鉴定;②应用荧光PCR检测X175菌株是否存在致泻性大肠埃希菌常见毒素基因(stx1/stx2/eae 、It/st、aggR/ipaH)及大肠埃希菌O104、H4基因;③应用PCR检测X175菌株是否存在肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O104∶H4的9个毒力基因.结果 ①经16SrDNA鉴定,X175菌株与大肠埃希菌埃希菌属的一些菌株相似度达99％,进化树显示X175菌株与大肠埃希菌O104:H4菌株的亲缘关系较近;②大肠埃希菌O104基因和ipaH基因检测结果均为阳性,stx1 /stx2/eae、lt/st、aggR、志贺菌/沙门菌、H4等基因检测结果均为阴性;③肠出血性大肠埃希菌O104∶H4九个毒力因子检测结果均为阴性.结论 X175菌株为大肠埃希菌O104弱毒型菌株,H抗原和其他一些特性还需进一步研究.
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中哈边境地区艾比湖湿地硬蜱分布及鉴定
目的 探究新疆阿拉山口艾比湖湿地蜱的种类、季节消长规律及其分子特征,为阿拉山口艾比湖湿地蜱的分类研究以及蜱传疾病的科学防控提供依据.方法 采用布旗法和动物体表搜集法在阿拉山口禾角克边防连、乌兰达布森管护站、艾比湖湿地国家自然保护区石头房子3个采样点,自2014年4-8月连续采集蜱,对采集蜱种进行形态学鉴定,并选取代表蜱种进行线粒体16S rDNA序列扩增与测序分析.结果 共采集蜱434只,其中游离蜱392只,寄生蜱42只;经体视显微镜形态学鉴定,采集样本为1科4属(扇头蜱属、璃眼蜱属、革蜱属、血蜱属)7种(亚洲璃眼蜱、边缘革蜱、银盾革蜱、血红扇头蜱、图兰扇头蜱、囊形扇头蜱、短垫血蜱);艾比湖湿地优势蜱种为亚洲璃眼蜱、边缘革蜱;蜱活动高峰集中在5-6月,革蜱属高峰出现在5月,亚洲璃眼蜱为6月;线粒体16S rDNA PCR测序比对结果显示,边缘革蜱与新疆石河子注册的KF547986同源性在96％～100％,亚洲璃眼蜱与新疆伊犁注册的KF527439同源性在98％～99％,血红扇头蜱与以色列注册的KF219732同源性在93％～94％.结论 首次在艾比湖湿地发现图兰扇头蜱和囊形扇头蜱;在国际上首次对短垫血蜱16S rDNA序列进行了分析和报道,该蜱与美国Haemaphysalis cretica同源性高(91.0％);艾比湖湿地地区边缘革蜱、亚洲璃眼蜱、血红扇头蜱16S rDNA存在多样性,来自不同蜱种遗传分支.
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牙周牙髓联合病变菌群的PCR-DGGE分析
目的 利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术观察牙周牙髓联合病变患牙牙周组织和根管中原始菌群分布状况及其异同,并通过克隆测序技术来试图探讨两部位可能存在的优势菌.方法 从13例牙周牙髓联合病变患牙分别采集患牙根尖1/3处牙周细菌和根管牙髓细菌,提取细菌总DNA,扩增16S rRNA基因可变区,再进行变性梯度凝胶电泳.应用SPSS17.0软件和Quantity One软件对DGGE图谱菌种条带进行统计学分析和聚类分析.对DGGE凝胶中有代表性的条带进行回收和克隆测序.结果 两取菌部位的菌种条带数间有明显的统计学差异(P＜0.01),但二者之间无正相关性.二者间的相似系数为13.1％ ～62.5％.牙周牙髓联合病变患牙根尖区1/3处牙周菌属可能有弯曲菌属(Campylobacter)、梭杆菌属(Fusobacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)等,该处对应根管中菌属可能有优杆菌属(Mogibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、放线菌属(Actinomyces)等.结论 牙周牙髓联合病变(牙周来源)中牙周组织和邻近根管牙髓组织中菌种在数目和结构上有明显不同.该病变牙周组织和根管中可能存在目前尚未被认知的优势菌种.
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16S rDNA快速鉴定血液制品中污染细菌的测序方法的建立
目的 建立基于16S rDNA快速鉴定细菌的PeR测序方法(PCR-SBT).方法 通过一组16S rDNA通用引物扩增得到基因组全长,PCR产物经纯化后直接测序分析.利用BLAST软件从GenBank数据库中搜索相关菌株的16S rDNA全序列,采用Clustal X软件进行多序列比对和同源性分析,确定细菌的种属,并与常规生化鉴定结果比较.利用大肠杆菌基因组一系列稀释度标本进行PeR扩增,检测方法的敏感性.结果 实验利用多对引物建立了16S rDNA全长序列分析方法,13个标准菌株通过PCR-SBT方法获得约1400 bp的全长序列.比对分析13个标准菌株测序结果与预期标准序列完全一致,证实建立的PCR-SBT方法结果可靠.利用建立的PCR-SBT法,对实验室从血小板制品和脐带血中分离得到不同未知菌株进行鉴定,成功确定了这些菌株的种属.以大肠杆菌DNA为模板,方法的低检测限为反应体系DNA含量0.2 ng.结论 建立的基于16S rDNA的PCR-SBT方法是可行的,可快速准确地检测及鉴定细菌种类,尽早发现细菌污染血制品,对污染血制品输注后的针对性治疗方面具有潜在的应用价值.
关键词： 血液细菌污染 16S rDNA 多聚酶链反应.测序方法 -
克雷伯菌16S rDNA和rpoB基因系统进化及序列特征分析
目的 比较分析克雷伯菌属的种之间16S rDNA和rpoB系统进化发育关系和序列进化特征.方法 选取经生化鉴定的克雷伯菌18株,提取菌株染色体作为模板,分别使用16S rDNA和rpoB通用引物扩增并测序16S rDNA和rpoB序列.与GenBank中目前已公布的8种克雷伯属菌株16S rDNA和rpoB序列各8条、除克雷伯菌外其他肠道菌株的16S rDNA和rpoB序列各9条一起,共计各35条16SrDNA和rpoB序列,在MEGA 4.0中建立进化树并进行分群分析,使用DNAStar/MegAlign程序比较分析8种克雷伯菌的种间16S rDNA和rpoB序列变异碱基位点,并做分歧度分析.结果 在所有受试的16SrDNA和rpoB的各35条序列中,16S rDNA和rpoB进化发育树都将克雷伯菌区分为3个群:分离的18株克雷伯菌中,15株肺炎亚种与GenBank中除产酸克雷伯菌和运动克雷伯菌外的其余6种克雷伯菌聚为一群(Ⅰ),其余3株克雷伯菌(FX246、FX280和FX286),经生化鉴定为产酸克雷伯菌,与GenBank中产酸克雷伯菌(DQ835530)聚为一群(Ⅱ);而GenBank中的运动克雷伯菌单独聚为一群(Ⅲ);进一步的分析,在rpoB进化发育树中,无沦足Ⅰ群和Ⅱ群,还足Ⅰ群内的两个亚群,rpoB进化发育树的结点处自引导值都明显高于16S rDNA进化发育树;而且rpoB对产酸克雷伯菌的分群优于16S rDNA.对克雷伯菌的序列分析发现,16S rDNA序列存在41个碱基变异位点,有4个易变区,rpoB序列存在63个碱基变异位点,有1个易变区;克雷伯菌16S rDNA和rpoB的相似性分别为95.9%～100%和90.2%～100%.进一步的克雷伯菌种间序列分歧值分析,rpoB分歧值(0～10.6)高于16S rDNA(0～4.0).结论 克雷伯菌rpoB比16S rDNA具有更高的分歧度,在克雷伯菌属内种的分子分类和鉴定中,rpoB比16S rDNA基因更具优越性.
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正常人群乙状结肠组织和粪便中菌群分布格局
目的 研究正常人群粪便和乙状结肠样本中的菌群种属分布特点.方法 采用16sDNA测序技术对13例新鲜粪便样本及10例乙状结肠黏膜样本菌群分布进行鉴定,并对其差异及特定的菌群进行分析.结果 粪便样本中的菌群多样性和丰度均高于乙状结肠黏膜组织,差异有统计学意义(P ＜0.001,P＜0.001,P=0.042,P=0.006).门水平菌群类别相同,包括厚壁菌门、拟杆菌们、变形菌门和放线菌门,但含量不同,粪便样本厚壁菌门和拟杆菌们显著高于乙状结肠黏膜组织,而变形菌门则显著低于乙状结肠黏膜组织,差异有统计学意义(P ＜0.001,P=0.025,P＜0.001).在属水平,粪便菌群以Faecalibacterium菌和拟杆菌属为主,乙状结肠黏膜组织以假单胞菌属、乳球菌属、不动杆菌属和黄杆菌属为主.两组中双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌数量均较低.结论 粪便样本和乙状结肠黏膜组织中菌群分布差异明显.
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建立16SrDNA 的 PCR-SBT 法细菌鉴定及在败血症中的应用
目的：建立16S rDNA PCR测序（PCR‐SBT）方法快速鉴定败血症患者体内的细菌菌种。方法对5株标准菌株及临床常见的20属27种细菌进行16S rDNA保守序列PCR扩增，扩增产物经纯化后直接测序，并利用Blast软件从GenBank数据库中搜索相关菌株的16S rDNA序列，采用Clustal‐X软件进行多序列比对和同源性分析，以确定细菌的种属；同时对124例败血症患者进行血培养并与PCR‐SBT 法比较，探讨其在临床应用中的价值。结果所有细菌菌株通过PCR方法均获得约1500 bp的保守序列，经测序分析后5株标准菌株的序列与预期标准序列完全一致，27种临床分离株测序鉴定结果与生化鉴定结果一致；124例败血症患者中84例PCR法阳性，阳性率67．7％，显著高于血培养的30．6％（P＜0．01）。结论建立16S rDNA的PCR‐SBT法鉴定细菌快速可靠，诊断败血症优于传统的血培养法。
关键词： 16S rDNA 多聚酶链反应-测序方法 败血症 -
微小小单胞菌与慢性根尖周炎临床症状的相关性研究
目的：研究慢性根尖周炎感染根管中微小小单胞菌( Parvimonas micra,Pm)的检出情况以及与慢性根尖周炎临床症状、体征的关系。方法采集104名慢性根尖周炎患者的120颗患牙根管内标本,其中包括初次治疗组(A组)和再次治疗组(B组)各60颗患牙。利用16S rDNA聚合酶链反应技术检测标本中的微小小单胞菌16S rDNA的表达；用比值比( OR值)的方法,分析Pm检出率与慢性根尖周炎临床症状及体征的关系。结果慢性根尖周炎初次治疗组检出Pm 24例,再次治疗组检出Pm 3例。2组结果通过比值比分析发现,随检出Pm几率增加,慢性根尖周炎根管内出现恶臭(A组OR=3．35,B组OR=14．29)或根尖出现大于5mm的根尖病变(A组OR=2.75, B组OR=6.70)的几率随之增加,95%可信区间下限>1,结果有显著性差异(P<0．05)。结论无论在初次治疗或再次治疗的慢性根尖周炎感染根管中均有Pm 检出。 Pm 可能在该疾病的发生发展过程中发挥一定作用。
