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用于我国新生儿HIV-1感染早期诊断的单管降落巢式三重PCR检测方法的建立
目的 我国面临着艾滋病母婴垂直传播的挑战.发展经济、有效的新生儿HIV-1感染早期诊断方法至关重要.本研究拟结合降落PCR、巢式PCR、多重PCR技术,以期建立一种能够在同一个PCR反应体系中同时扩增Env、Gag、Pol三个基因区的单管降落巢式三重PCR方法用于我国新生儿滤纸干血斑样本(DBS)中的HIV-1前病毒DNA检测,并对所建立的方法进行初步评价.方法 样本采自云南、新疆、广西、河南四省HIV-1阳性母亲所生婴儿.用18个DBS样本进行方法优化(感染婴儿及未感染婴儿样本分别9个).采用由重组质粒及8E5细胞制备的涵盖HIV-1各亚型的DNA稀释盘确定方法的亚型适用性及检测下限.采用134个DBS样本进行临床评价(含25个感染婴儿的64个DBS样本及30个未感染婴儿的70个DBS样本).结果 所建方法对HIV-1 A、AE、AG、B、BC、C、D、F、H亚型均可适用,检测下限为3拷贝/PCR反应体系；其临床特异度100％,阳性检出率在3月龄时接近95％、6月龄时可达到100％.结论 本研究建立的方法能够检测出我国新生儿DBS样本中各亚型的HIV-1前病毒DNA,且省时、省力、节约成本,在我国新生儿HIV-1感染的早期诊断领域具备应用潜力.
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分析筛查新生儿干血斑β地中海贫血的方法及效果
目的:探讨全自动毛细管微量血红蛋白电泳技术在新生儿β地中海贫血筛查中的应用价值.方法:收治新生儿145902例,采用Sebia全自动毛细管电泳仪进行血红蛋白电泳.对95058例标本以HbA界值法读出β地中海贫血筛查结果,对50844例标本根据HbA值结合HbA2/HbA比值读出β地中海贫血筛选结果.随机选取598份结果判读β地中海贫血筛选结果,同时基因检测为β地中海贫血金标准.结果:HbA界值法β地中海贫血符合率45.2%、假阳性率54.8%;综合分析法β地中海贫血符合率73.5%,假阳性率26.5%.HbA与综合分析敏感度与特异度分别54.54%、90.90%和97.57%、99.30%.综合分析法在阳性预测值与筛选准确性等方面高于HbA界值法.结论:综合分析法在筛选新生儿β地中海贫血,判断电泳结果上灵敏度与精确度等较高.
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应用BED-CEIA检测干血斑样本监测HIV-1发病率的可行性研究
目的 研究干血斑样本应用于现场HIV-1 BED-CEIA新近感染的检测以及监测HIV-1发病率的可行性.方法 收集27个自愿咨询检测(VCT)哨点的10 313名咨询者的血浆和干血斑样本,进行HIV抗体检测,对经免疫印迹方法确认的349例HIV感染者的血浆和干血斑样本同时进行BED-CEIA检测,检验干血斑样本BED-CEIA新近感染检测结果的稳定性和重复性,比较两种样本检测结果的差异及对HIV发病率估计的一致性.结果 应用干血斑样本检测具有较好的稳定性和重复性,R2值分别达到0.9551和0.95.349对样本的检测结果显示,294对样本被同时判定为长期感染,53对样本被同时判定为新近感染,两种样本对HIV-1是否为新近感染判断的一致性达到99.43%.而2对样本得到不同的结果,其An值均处于临界值附近.在人群总体水平上,两种样本计算得到的HIV-1发病率完全一致.结论 在HIV-1 BED-CEIA新近感染检测中,尽管个别样本检测结果存在差异,但在人群水平上千血斑样本的检测结果对HIV-1发病率的估计与血浆样本没有差异,因此在中国可以应用于血斑样本进行HIV-1 BED-CEIA新近感染检测.
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以新生儿足跟血滤纸干血斑为标本的地中海贫血群体筛查研究
目的 研究海口新生儿地中海贫血基因携带率、基因型构成,探讨利用新生儿足跟血滤纸干血斑为标本进行新生儿地贫群体筛查的方法.方法 实证研究的方式,2016年1至12月,采用机械抽样法,每日抽取25%~50%海口市30家医院出生的海口市户籍新生儿足跟血滤纸干血斑标本,总计6864份,行血红蛋白电泳,电泳实验结果异常标本,召回新生儿抽血,再行地贫基因检测,汇总数据分析滤纸干血斑标本行新生儿地贫群体筛查的可行性.结果 6864份新生儿滤纸干血斑标本中,电泳初筛阳性604份,阳性率8.80%,电泳阳性标本确诊携带地贫基因343份,携带率5%(343/6864),其中 α-地贫基因281份,占81.92%(281/343),β-地贫基因57份,占16.62%(57/343),α-合并β-地贫基因5份,占1.46%(5/343).α-地贫病例中,缺失型占89.68%(252/281),以--SEA/αα为主;非缺失型占4.98%(14/281),以αQSα/αα为主;缺失型杂合非缺失型占α-地贫病例5.34%(15/281),以-α3.7/αWSα为主.β-地贫病例中,检出9种基因型,以CD41-42/N为主,占β-地贫基因携带病例的61.40%(35/57).α-地贫病例中,缺失型占89.68%(252/281),以--SEA/αα为主;非缺失型占4.98%(14/281),以αQSα/αα为主;缺失型杂合非缺失型占α-地贫病例5.34%(15/281),以-α3.7/αWSα为主.β-地贫病例中,检出9种基因型,以CD41-42/N为主,占β-地贫基因携带病例的61.40%(35/57).结论 海口市新生儿地贫基因携带率高,基因型分布有地域特点,以α-地贫为主.新生儿足跟血滤纸干血斑为标本行地贫群筛的方法可大力推广.
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两种早期诊断婴儿HIV-1感染方法的一致性评价
目的 评价In-house方法与商品化雅培RealTime艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)定性检测试剂盒(简称雅培试剂盒),检测婴儿足底血干血斑(DBS)早期诊断的一致性.方法 收集217份来自四川、重庆、江苏、新疆等地寄送的HIV阳性母亲所生婴儿的待检DBS样本,用In-house方法检测HIV-1前病毒脱氧核糖核酸(DNA),用雅培试剂盒进行定性检测,并用SPSS 19.0进行统计学分析,从而评价两种方法检测结果的一致性.结果 217份婴儿DBS样本,用In-house方法检测结果为10例阳性和207例阴性,用雅培试剂盒检测结果为9例阳性和208例阴性,两种方法检测不一致的有3例,分析得一致率为98.6％(214/217),Kappa值为0.835,95％可信区间(CI):0.652～1.000,P＜0.05.结论 用DBS进行In-house与雅培试剂盒检测,对婴儿早期诊断具有较好的一致性,二者均可用于中国婴儿的早期诊断,为中国HIV婴儿早期诊断(EID)检测方法的选择提供了科学依据.
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干血斑样本用于HIV抗体检测方法学优化与应用
目的 探讨用于干血斑样本中艾滋病病毒(HIV)抗体检测的佳洗脱条件.方法 选取并制备中值(24)与低值(2 6)的干血斑样本,利用HIV抗体诊断试剂盒(酶联免疫吸附试验法),对不同洗脱温度、不同洗脱液组分、不同洗脱液体积、不同洗脱时间分别进行组合后,进行干血斑(DBS)样本洗脱液中抗体OD值测定分析,从而选出适宜、方便用于HIV抗体检测的DBS洗脱条件.结果 室温与4℃条件下洗脱样本差异无统计学意义(P=0.979,P=0.704);不同洗脱液体积对样本洗脱的影响差异无统计学意义(P=0.183);洗脱液组分对低值(2 6)样本的洗脱效果有统计学意义(P=0.033),其中以含0.5‰Tween 20的PBS对样本洗脱的影响更为显著(P=0.02,P=0.004);洗脱时间对中值(24)与低值(2 6)样本均有显著影响(P=0.00,P=0.00),其中4小时和6小时为显著差异分界点.670份临床已知样本的检测应用中,试剂盒现成Cutoff值计算判定阳性样本时,存在2.63％的假阳性,无假阴性.结论 用于DBS中HIV抗体佳洗脱条件为:用300μL含有0.5‰Tween 20的PBS在室温下(24±2℃)洗脱4～6小时.试剂盒Cutoff值不适用于DBS样本结果判定,需进一步研究设定用于该方法的Cutoff值.
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新生儿干血斑β地中海贫血筛查方法的研究
目的：探讨全自动毛细管微量血红蛋白电泳技术在新生儿β地中海贫血筛查中的应用价值，并寻求有效的筛查方法。方法使用 Sebia 全自动毛细管电泳仪对145904例新生儿滤纸干血斑标本进行血红蛋白（Hb）电泳；对95059例标本的电泳分析结果以 HbA 界值法判读β地贫筛查结果，对50845例标本的电泳分析结果以 HbA 值结合HbA2／HbA 比值的综合分析法判读β地贫筛查结果，召回筛查阳性者进行地贫基因诊断；随机对600份标本的电泳结果同时以上述两种方法判读β地贫筛查结果，同时进行基因检测作为β地贫诊断的金标准，统计比较两种判读方法的差异。结果HbA 界值法筛查出的1580例阳性标本中经基因检测确诊为β地贫的有716例，确诊符合率45.32％，假阳性率为54．68％；综合分析法筛查出的1266例 阳 性 标 本 中 930例经基因检测确诊为β地贫，符合率73.46％，假阳性率为26．54％。同时对600例新生儿干血斑分析结果表明，HbA 界值法和综合分析法的敏感度和特异度分别是54．55％、90．91％和97．58％、99．31％，两者的筛查准确性分别为96％和99％。统计结果表明，综合分析法的敏感度、阳性预测值和筛查的准确性显著高于 HbA 界值法．结论新生儿干血斑标本经毛细管血红蛋白电泳后，利用包含 HbA、HbA2组分的含量及 HbA2／HbA 比值的综合分析法判读电泳结果，筛查新生儿β地贫，灵敏度和准确性显著提高，假阳性率明显降低，值得推广应用。
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茂名地区新生儿地中海贫血应用干血斑毛细管电泳技术筛查结果分析
目的 研究并探讨干血斑毛细管电泳技术在新生儿地中海贫血筛查中的应用价值.方法 选取2015年1月至2016年6月,茂名地区出生的81011例新生儿作为研究对象,于新生儿出生后3天后7天内采集其足跟血1滴制成干血斑,采用全自动毛细管电泳分析系统对干血斑中的血红蛋白进行电泳定量分析,统计血红蛋白电泳异常标本.对血红蛋白电泳异常标本进行进一步的聚合酶链反应结合DNA测序,以基因检测结果作为金标准,计算干血斑毛细管电泳检测对α-地中海贫血、β-地中海贫血、异常血红蛋白病的诊断符合率.结果 81011例新生儿的干血斑标本经毛细管电泳检测出13405例血红蛋白异常,其中疑似α-地中海贫血9588例,疑似β-地中海贫血3527例,疑似异常血红蛋白病共290例.其中有3513例筛查阳性病例召回经基因检测确诊,α-轻型地贫2493例,β-轻型地贫724例,α-中间型地贫(Hb-H)85例,β-重型地贫31例,其中正常180例,干血斑毛细管电泳检测对α-地中海贫血的诊断符合率为95.06%,对β-地中海贫血的诊断符合率为94.26%.结论 在新生儿地中海贫血的筛查中,采用干血斑毛细管电泳技术进行筛查可对地中海贫血有效检出,具有显著的应用价值,在大力开展人群筛查的基础上加强产前诊断,指导合理婚配,降低重型和中型地贫儿即Hb-Bart's水肿胎和Hb-H病β-重型的出生,提高出生人口的素质.
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干血斑和血清样本用于检测乙型肝炎病毒DNA及耐药突变的比较
目的：验证干血斑（DBS）样本替代静脉血血清样本用于检测乙型肝炎病毒（HBV）基因诊断的可行性。方法选择慢性乙型肝炎患者100例，血清HBV的病毒载量>1×102拷贝/mL，抽取静脉血同时制备DBS样本和血清样本，进行HBV DNA定量检测，比较DBS与血清样本检测结果的相关性。选取73例基因型主要为B、C型的患者，进行DBS和血清样本基因型检测的比较。同时随机选取56例乙型肝炎患者的DBS和血清样本，采用实验室自建的套式聚合酶链反应（PCR）扩增HBV的逆转录酶（RT）区段，通过geno2pheno数据库进行结果分析，比较二者耐药性的检测结果。结果 DBS样本HBV DNA的检测范围为2～8 log10拷贝/mL，与血清样本HBV DNA的检测结果高度相关（r2=0.82，P<0.05），DBS样本HBV DNA定量值比血清样本低1个数量级。2种样本HBV耐药性检测结果的总符合率为95.83%；DBS和血清样本耐药状态的检出率分别为82.14%和85.71%（P>0.05）。2种样本HBV基因分型结果的符合率为100.00%。结论 DBS样本可用于HBV DNA的定量及耐药性的检测。
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不明原因复发性流产患者干血斑中多种氨基酸水平分析
目的:采用高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法检测不明原因复发性流产患者(URSA)干血斑中多种氨基酸含量,探讨血中氨基酸水平的变化与URSA的关系.方法:采用API 3200型LC-MS/MS检测35例URSA患者和20例正常早孕妇女干血斑中11种氨基酸水平,比较两者的差异.结果:URSA患者干血斑中被检氨基酸(除精氨酸外)水平明显高于正常早孕妇女(P＜0.05).结论:LC-MS/MS法可用于检测不明原因复发性流产患者血中氨基酸谱的变化,URSA患者血中氨基酸水平有明显的变化.
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滤纸片干血斑检测TT病毒DNA
目的建立一种快速、方便、准确的方法检测TT病毒的基因片段.方法采集被检者全血滴在经EDTA--蛋白酶预处理的滤纸片上,室温干燥后,密封并保存于-20℃,然后进行PCR检测;同时取血清用传统方法作对照.结果在相同时间内,本法测得的结果,与传统方法所得结果无异.结论该方法具有特异、敏感、方便等特点,用此法检测TTV DNA是切实可行的.
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一种灵敏的干血斑葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光分析法的建立
目的 建立葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶(G6PD)荧光分析方法,用于新生儿足跟干血斑中G6PD酶活性的定量测定.方法 选择于血斑配制基质,优化底物、复溶物和铜试剂组分,建立G6PD荧光分析法定量检测方法,并对该试剂的各项性能指标进行评价.结果 自制试剂分析灵敏度为0.05 U/g Hb;分析内和分析间精密度分别为4.12%-8.93%、4.75%～9.86%:试剂的cutoff值为2.23 U/g Hb;1 066份样本用该试剂与PerkinElmer(PE)公司同类试剂平行榆测,两种试剂测值具有显著相关性(P=0.000),相关系数为0.960;以PE公司试剂为对照,本试剂的阳性符合率为99.4%,阴性符合率为98.93%.结论 该试剂灵敏度高、操作简便快捷,具有良好的精密度.临床检测性能良好,可以满足临床应用的需要.
关键词： 葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶 荧光分析法 干血斑 -
滤纸干血斑 DNA 自动化提取及其在地中海贫血基因诊断中的应用
目的：研究滤纸干血斑（DBS）DNA 的自动化提取方法及其在地中海贫血（地贫）基因诊断中的应用。方法将276份经静脉血标本基因检测确诊为地贫的孕妇外周血标本按照研究需要分别制成240份合格、18份渗透不良和18份重复滴血滤纸干血斑标本，并模拟不同的运输和储存条件。使用 Lab-Aid 820核酸提取仪对滤纸干血斑进行 DNA 提取，考察不同的起始血斑用量检测的准确度，对提取的 DNA 进行浓度和纯度分析，并分别使用荧光 PCR 熔解曲线法和 PCR 联合膜杂交法对DNA 进行地贫基因检测。结果276份滤纸干血斑标本提取的 DNA 浓度9.85～29.56 ng／μl，纯度1.63～1.95，均能满足试剂盒检测要求，其中2种基因型检测方法的检测结果100％符合，2种方法均检出地贫基因突变 IVS-Ⅱ-654（C ＞T）、-28（A ＞G）、CD17（A ＞T）、CD26（G ＞A）、CD41／42（-TTCT）、--αSEA、-α3.7、--α4.2、αCSα，所有结果均与使用静脉血提取 DNA 作为标本的检测结果100％符合，覆盖了目前临床上常见的各种基因型。结论DBS 标本对运输、保存要求较低，结合自动化核酸提取仪提取 DNA，操作简单、提取结果稳定，可用于临床筛查地贫基因。
关键词： 干血斑 地中海贫血 DNA 提取 荧光 PCR 熔解曲线法 -
滤纸干血斑制备疟原虫DNA 模板的方法评价
目的：评价滤纸干血斑制备疟原虫DNA模板的方法。方法采用常规DNA抽提程序和PCR扩增程序，收集并检测47份疑似输入性疟疾患者标本，统计分析配对设计的检测结果。结果滤纸干血斑 PCR与厚薄血涂片检测结果比较K ap p a＝0．492，与全血标本PCR检测结果比较 K ap p a＝0．686；分别以厚薄血片镜检和全血标本进行的PCR检测为金标准，滤纸干血斑采集血样进行PCR检测的灵敏度分别为75．0％和71．4％，特异度分别为78．9％和100．0％。结论滤纸干血斑采集血液标本进行PCR检测尚不能取得良好的效果，仍需进一步研究。
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干血斑标本珠蛋白生成障碍性贫血基因检测方法的建立?
目的：建立并优化干血斑标本基因组DNA提取方法和流程,以适用于临床进行珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血,以下简称“地贫”)基因诊断,并对干血斑打孔标本间可能的交叉污染和保存的稳定性进行分析。方法收集150份血液标本制备干血斑后,采用打孔仪打孔,用洗脱裂解液对血斑进行洗脱,并对洗脱方法进行优化,采用磁珠法提取血斑 DNA,再进行地贫基因检测,判断干血斑和全血的地贫基因检测结果是否相符。干血斑采用2种地贫基因检测方法进行检测,以验证其是否适用于多种方法。地贫阳性标本间打空白孔,对空白孔进行地贫基因检测确定打孔是否存在交叉污染。将干血斑常温干燥保存6、9个月后进行地贫基因检测,以判断其稳定性。结果采用5个3 mm 直径的干血斑在55℃振荡洗脱1 h,可以获得 DNA 浓度10~20 ng/μL(50μL DNA 溶解液),DNA 质量好。干血斑和全血的地贫基因检测结果完全一致,干血斑的2种地贫基因检测方法的结果也完全一致。打孔仪连续对干血斑打孔,地贫基因未检测出交叉污染。干血斑标本存放6、9个月后依然能够稳定地进行地贫基因检测。结论干血斑标本可以准确、方便、稳定地进行地贫基因检测,是地贫基因检测标本转诊的理想方式。
关键词： 珠蛋白生成障碍性贫血 基因诊断 干血斑 基因组 DNA -
西罗莫司血药浓度监测的研究进展
目的：跟踪西罗莫司血药浓度监测的研究进展。方法：查阅近年来国内外相关文献，对西罗莫司的药动学和生理药动学模型（PBPK）的应用、西罗莫司血药浓度监测的样本和方法的研究进行归纳和总结。结果：PBPK预测性能良好，在临床剂量递增方案中能预测到±20％的浓度-时间曲线下面积值。选择干血斑样本进行检测，并进行预处理消除离子干扰，有利于提高检测结果的准确度。分析监测生物样本血药浓度的方法包括免疫法和色谱法，两种方法相关性已明确。结论：西罗莫司血药浓度监测的方法得到优化，精确度得到提高，可联合基因检测为患者制订给药方案，使患者得到更安全、合理的药物治疗。
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通用S&S903滤纸与PE产干血膜滤纸临床应用比较
目的:临床新生儿筛查、产前筛查干血斑(DBS)的制备均用S&S903滤纸,将近期PE公司推出的新滤纸试用于新筛与产筛中,以了解其临床应用价值.方法:采用干血片AFP/游离hCG β亚基双标测定试剂盒(时间分辨荧光法).结果:经干血片法产筛检测AFP、βhCG结果显示两者P＞0.05,散点图显示AFP r=0.866、βhCG r=0.964,βhCG相关性优于AFP.结论:传统应用的S&S903滤纸与PE公司近期推出的滤纸在产前筛查干血斑法检测中是可行的.
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HIV-1母婴传播早期诊断应用
目的:应用核酸扩增技术对母婴传播婴幼儿人类免疫缺陷病毒(HIV)感染进行早期诊断,为临床防治提供依据.方法:收集2010～2011年HIV阳性孕产妇活产的32例1～11个月龄婴幼儿足底干血斑样本进行HIV-1DNA检测.随访18个月后进行血清HIV抗体检测比较.结果:32例婴幼儿中,检出HIV-1DNA阳性4例,检出率12.5％,其后随访血清抗体也为阳性；其余28例DNA与血清抗体均为阴性.两种检测方法符合率为100.0％.结论:核酸检测是有效的早期诊断方法,早期诊断有利于后续开展母婴阻断工作.
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采用干血斑进行丙肝病毒RNA检测的研究
目的 用干血斑(dried blood spot,DBS)取代静脉血作为检测HCV RNA的样品来源的可行性.方法 评价该方法的检测限、批间和批内变异.用HCV RNA阴性的血液将第二代HCV RNA国际标准(WHO,HPA UK)稀释后浓度分别为1 000,500,250和150 IU/ml的样品检测.批间变异是通过反复检查单个1 000 IU/ml DBS对照超过20次PCR反应.批内变异则是通过一次PCR反应,在20个反应孔检测1 000 IU/ml对照DBS.从单个已知血液样品HCV阳性的标本制备成DBS后在不同温度和时间进行评估检测HCV RNA的影响,如室温下,4℃,-20℃和-80℃.另外在不同时间点检测,如1,2,4,6,9和12个月.结果 DBS样品检测HCV RNA的检测限为250IU/ml.1 000 IU/ml 样本的批间和批内变异系数(CV)分别为2.5%和2.2%.灵敏度和特异度分别为100%和95.8%.在不同温度保存超一年的DBS样品中HCV RNA是稳定的.结论 笔者建立了一种灵敏和稳定的采用DBS检测HCV RNA的方法.用干血斑作为一种样品有利于对高危人群HCV RNA的检测.
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滤纸片干血斑在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测方法中的应用
目的 评价滤纸片干血斑在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测中洗脱液放置时间对结果判定的影响.方法 使用2013年新发感染干血斑国际考核盘进行HIV-1 BED-CEIA检测,检验干血斑考核盘在BED-CEIA新发感染检测结果的稳定性与可重复性;洗脱液放置13h、17h、20 h、24 h、32 h后检测,进行随机区组设计方差分析.结果 检测稳定性较好,6次检测质控品吸光度值(OD值)与标化吸光度(ODn值)的变异系数(CV)＜15％;国际考核盘干血斑样8份,其不同放置时间5次检测判定为新发感染结果一致,即可重复性好;洗脱液放置13h、17h、20h、24 h、32h后检测,标化吸光度(ODn值)差异无统计学意义(x2=0.705 7,P＞0.05).结论 在HIV-1 BED-CEIA新发感染检测中,干血斑样本的检测结果具有较好的稳定性与可重复性,因此可以在今后检测工作中,应用干血斑样本进行HIV-1 BED-CEIA新发感染检测.
