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无症状人芽囊原虫感染调查及PCR鉴定
目的调查当地居民人芽囊原虫感染情况,用PCR鉴定方法进行初步的分子生物学研究.方法收集当地居民粪便标本,碘染色法镜检人芽囊原虫,体外分离培养并观察其形态及繁殖方式,提取人芽囊原虫基因组DNA,用针对人芽囊原虫SSu rDNA的特异性引物进行PCR鉴定.结果共调查415例当地居民,镜检发现4例阳性,均为无症状人芽囊原虫感染者,阳性率0.96%,未见其他寄生虫合并感染.分离培养观察形态主要为空泡型和颗粒型,未发现阿米巴型和包囊型.繁殖方式以二分裂为主,偶见出芽生殖及三分裂,未发现裂体生殖.PCR扩增获得特异性的阳性条带.结论无症状人芽囊原虫感染率较低,可以通过扩增其SSu rDNA进行鉴定.
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分子信标技术在 ABO 血型基因型检测方面的重要应用
目的：人类 ABO 血型的检测在医学和法学领域都有着非常重要的意义，该研究目的在于发展一种利用非血生物学样本进行人体 ABO 血型的精确检测方法。方法该项研究中，选取漱口水、毛发和指甲3种生物样本，采用饱和氯化钠法进行基因组 DNA 的抽提，设计特异性引物和荧光标记的探针，通过分子信标检测技术法进行血型的精确检测。结果漱口水、毛发和指甲3种样本中均能成功抽提得到基因组 DNA ，分子信标技术利用基因组DNA能够快速完成 ABO 血型精确分型，分型结果与传统的免疫学方法一致，且能准确区分血型的纯合型和杂合型。结论利用漱口水、毛发和指甲等非血生物学样本，分子信标技术能精确完成个体 ABO 血型的检测，简便快捷，灵敏度高。
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血液基因组 DNA 提取方法的改良
目的：探讨改良血液样品基因组 DNA 的提取方法，制备纯化的高分子量 DNA。方法将312份新鲜血液样品随机分为2组：A 组（90份）和 B 组（222份）。A 组采用常规基因组 DNA 提取方法。B 组采用改良的基因组 DNA提取方法，其基因组 DNA 提取方法改良之处：1）在血液样品中加入细胞裂解液 CL 后采用手工震荡，并离心2 min 40 s；2）震荡混匀后将样品分装成3管，然后将缓冲液 GS 加入第1管吹打溶解后吸取上清，并加入第2管，再吹打溶解后吸取上清加入第3管，继续吹打溶解；3）加入缓冲液 GB 后再58℃水浴过夜16 h。结果改良的血液样品 DNA 提取方法能够提高产率，提高纯度，获取更多高分子量的 DNA，相对于常规基因组 DNA 提取方法有显著提高。结论改良的血液基因组 DNA 提取方法操作简便，能有效地避免操作导致 DNA 链断裂，提高 DNA 的完整性及纯度。
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常备试剂法提取人外周血 DNA
目的：探讨使用一种常备试剂提取外周血 DNA，而无需 PK、毒性有机溶剂或特殊缓冲液。方法分别使用常备试剂法、试剂型 kit 法和柱式型 kit 法提取外周血 DNA，进而比较3种方法的 DNA 产量和质量。结果使用常备试剂法，提取200μL 人外周血的 DNA 量为（5．77±3．49）μg，低于试剂型 kit 法（P ＜0．05），但与柱式型kit 法（P ＝0．10）差异无统计学意义。常备试剂法提取的 DNA 样品，A230／A260为0．49±0．05，A260／A280为1．98±0．10，片段大于15 kb，AluI、BamHI-HF 酶切完全，PCR 扩增稳定、高效，DNA 质量与两种 kit 法差异无统计学意义。常备试剂法的每样品耗费低，操作时间约30～40 min。结论常备试剂法能够保证外周血 DNA 产量和质量，试剂方便易得，操作快速、安全，且费用低廉，可作为一般实验室备选方案。
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超声波细胞粉碎机在高通量测序片段化 DNA 中的应用
目的：探讨超声波细胞粉碎机在高通量测序中应用的佳 DNA 片段化条件。方法 DNA 样品在冰浴条件下采用不同的超声功率、单次间隙时间和超声时间、工作时间(单一样品超声破碎时间)、仪器连续工作时间,通过琼脂糖凝胶电泳和2100生物分析仪分别检测基因组 DNA 片段化和羟甲基化免疫共沉淀效果。结果超声功率280 W、间隙时间/超声时间5 s/5 s、总工作时间18 min,仪器连续工作时间不超过90 min,超声波处理时样品始终保持冰浴环境可获得高通量测序需要的、长度主要集中在200~500 bp 之间的 DNA 片段。结论在我们优化的实验条件下,利用超声波细胞粉碎机可以得到重复性较好的基因组 DNA 片段,可满足高通量测序文库构建中对 DNA 片段质量的要求。
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T aqM an 荧光定量 PCR 检测新型隐球菌方法的建立
目的：建立 TaqMan 荧光定量 PCR 方法定量检测新型隐球菌基因组 DNA ，为检测隐球菌性脑膜炎提供重要方法。方法在国家生物技术信息中心（NCBI）查找新型隐球菌各亚型的 ITS‐rDNA 序列，序列比对后设计特异性引物和探针，扩增片段为114 bp ，构建质粒标准品，调整质粒浓度为1．42×108 copy／μL ～1．42×10 copy／μL 共8个浓度梯度，分别取2μL 作为模板，优化反应条件，建立标准曲线，进行敏感性、特异性、重复性评价，并检测临床确诊的15例隐球菌脑膜炎感染菌株。结果建立的荧光定量 PCR 可以检测2．84×102拷贝的质粒 DNA ，对临床分离的各10例其他真菌、细菌、乙型肝炎病毒 DNA 和人类基因组 DNA 均无扩增曲线，重复性良好，3个浓度的批间变异系数分别为2．86％、1．48％、1．36％，可准确检测15例新型隐球菌。结论成功建立检测新型隐球菌的荧光定量 PCR 方法，敏感性和特异性较高，结果稳定可靠，可早期、快速诊断隐球菌性脑膜炎。
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干血斑标本珠蛋白生成障碍性贫血基因检测方法的建立?
目的：建立并优化干血斑标本基因组DNA提取方法和流程,以适用于临床进行珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血,以下简称“地贫”)基因诊断,并对干血斑打孔标本间可能的交叉污染和保存的稳定性进行分析。方法收集150份血液标本制备干血斑后,采用打孔仪打孔,用洗脱裂解液对血斑进行洗脱,并对洗脱方法进行优化,采用磁珠法提取血斑 DNA,再进行地贫基因检测,判断干血斑和全血的地贫基因检测结果是否相符。干血斑采用2种地贫基因检测方法进行检测,以验证其是否适用于多种方法。地贫阳性标本间打空白孔,对空白孔进行地贫基因检测确定打孔是否存在交叉污染。将干血斑常温干燥保存6、9个月后进行地贫基因检测,以判断其稳定性。结果采用5个3 mm 直径的干血斑在55℃振荡洗脱1 h,可以获得 DNA 浓度10~20 ng/μL(50μL DNA 溶解液),DNA 质量好。干血斑和全血的地贫基因检测结果完全一致,干血斑的2种地贫基因检测方法的结果也完全一致。打孔仪连续对干血斑打孔,地贫基因未检测出交叉污染。干血斑标本存放6、9个月后依然能够稳定地进行地贫基因检测。结论干血斑标本可以准确、方便、稳定地进行地贫基因检测,是地贫基因检测标本转诊的理想方式。
关键词： 珠蛋白生成障碍性贫血 基因诊断 干血斑 基因组 DNA -
人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA 方法的初步研究
目的：探索从人类口腔黏膜上皮细胞中提取基因组 DNA 方法的可行性。方法分别采用煮沸法和碱裂解法从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA ，然后与临床常用的碘化钠（NaI）法提取的人全血基因组 DNA 进行比较。结果煮沸法和碱裂解法2种方法均能从口腔黏膜上皮细胞抽提到 DNA ，提取的 DNA 浓度虽低于 NaI 法，但用2种方法提取到的 DNA 样品进行聚合酶链反应，均能获得满意效果，与常规 NaI 法无明显差异。结论从人口腔黏膜上皮细胞提取基因组 DNA 简便、快捷、无损，在临床上具有潜在的应用价值。
