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H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析
利用RT-PCR方法,扩增了1998～2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析.序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%～99.8%和93.6%～100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在.NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础.
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云南省2009～2010年肠道病毒71型的基因特征分析
为了解引起云南省2009～2010年手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的基因特征,对从病例中分离到的50株EV71,进行VP1编码区逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增和核苷酸序列测定,构建遗传进化树进行基因型别分析.50株分离株VP1编码区全长均为891个核苷酸,编码297个氨基酸,序列比较证实为EV71.进化分析表明,云南省EV71分离株48株属于C4a亚型,2株属于A型.说明云南省2009～2010年流行的EV71和中国大陆其他地区2004年以来的EV71分离株同属C4a亚型,在不同地区、不同疾病状态下分离的EV71在VPI区全长基因序列上无明显差别,但2009年在云南省出现A基因型的传播.
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广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2基因进化和变异分析
比较和分析2009～2011年广州地区分离到的甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因和世界各地甲型H1N1流感病毒PB1-F2基因的变异情况,为该蛋白的功能和作用机制奠定基础.对分离自中国广州地区2009～2011年人类感染的17株新型H1N1和1株季节性H1N1流感病毒进行了PB1-F2基因克隆和序列测定,通过与GenBank数据库中68株人类新型H1N1和季节性H1N1流感病毒参考株的PB1-F2基因进行比对.结果表明,甲型流感病毒的PB1-F2基因进化树形成了2个不同的进化分支.全部2009～2011年新型H1N1流感病毒为一分支.广州地区PB1-F2基因与其它地区分离到的新型H1N1流感病毒具有高度的同源性,均为截短型变异.本实验室分离的1株季节性H1N1流感病毒也发生了第12位氨基酸截短突变.广州地区新型H1N1流感病毒PB1-F2截短蛋白与其它地区病毒相比未发生氨基酸变异,季节性H1N1流感病毒发现类似新型H1N1流感病毒PB1-F2的截短变异,提示新型H1N1流感病毒和季节性H1N1流感病毒PB1-F2可能发生早期重组.
关键词： 新型H1N1流感病毒 PB1-F2 进化分析 -
中国首例输入性中东呼吸综合征冠状病毒结构基因与附属基因的序列分析
针对中国首例实验室确诊输入性MERS-CoV感染病例,采用鼻咽拭子样品进行核酸提取、基因扩增与测序,获得MERS-CoV_ ChinaGD01结构蛋白与附属蛋白编码基因,包括S基因、E基因、M基因、N基因、ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5和ORF8b基因序列.根据S基因进化分析发现中国输入性病例中MERS-CoV虽有少数位点变异,但仍与近年沙特流行株相近,属于MERS-CoV亚型5,N、E、M等结构基因核苷酸变异较少.附属蛋白进化分析表明:ORF3、ORF4a、ORF4b、ORF5均有一定的核苷酸替换,而ORF8b相对保守.总之,中国首例输入性MERS-CoV与已发表序列相比总体表现为保守,但在部分基因序列上有一定的变异.这是中国首例输入性MERS-CoV的第一次基因分析结果报道,可为该MERS-CoV感染特点的进一步研究及相关疾病的防控提供参考.
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湖南省2009～2014年分离埃可病毒6型的基因特征分析
为了解中国埃可病毒6型(Echovirus type 6,ECHO6)的基因特征.通过对2009～2014年从湖南省手足口病病例监测中分离到的6株ECHO6病毒部分VP1序列测定,并与来自中国5个省和世界范围的138株ECHO6病毒进行序列对比和构建系统进化树.中国ECHO6病毒形成2个彼此独立的进化分支,分支1和分支2.湖南省ECHO6病毒均聚集在2c亚分支中,可能具有共同的进化来源.分支2病毒在我国分布较广且流行时间较长,可能是我国的优势流行株.以核苷酸差异＞30％为分组依据,可将ECHO6病毒划分为4个基因组A～D,以核苷酸差异在15％～30％之间分组,将D基因组再划分为10个基因亚组,D1～D10.湖南省ECHO6病毒均属于D7基因亚型.研究结果显示,2009～2014年期间,湖南省存在着具有共同进化来源的ECHO6病毒流行.中国至少存在4个不同进化分支的ECHO6病毒流行.
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犬圆环病毒全基因组克隆与序列分析
犬圆环病毒(Dog circovirus,DogCV)是近年来新发现的一种哺乳动物圆环病毒.为研究DogCV中国流行毒株基因组特性和遗传进化,以犬血清样品提取的DNA为模板,采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列,命名为JZ98/2014.序列分析表明JZ98/2014全基因组长度为2063nt,编码3个主要开放阅读框:ORF V1(Rep蛋白,303个氨基酸)、ORF C1(Cap蛋白,270个氨基酸)和ORF C2(106个氨基酸).同源性比较显示JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株的全基因组序列同源性为82.1 ％-89.5％,而Rep和Cap基因同源性分别为82.1％-89.5％和84.6％-89.1％.遗传进化树分析显示,目前世界流行的DogCV存在多个分支,而JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株处于不同分支.
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人博卡病毒2基因组扩增及序列分析
为获得人博卡病毒2 (Human bocavirus 2,HBoV2)基因组序列,以2010年HBoV2单阳粪便标本为材料,PCR方法扩增HBoV2基因组不同区域,经序列拼接后得到5444bp的全基因组序列(HBoV2-NC).系统进化分析显示,HBoV2-NC与兰州株HBoV2亲缘关系近;DINAMelt末端回文结构预测证实,HBoV2-NC 5'末端存在反向互补序列,具有典型的细小病毒末端的茎环样结构;接头法PCR扩增得到HBoV2-NC部分末端侧翼序列.
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中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析
本文首次对我国现行狂犬病疫苗生产用毒株CTN-1进行全长基因组序列测定和分析,为CTN-1疫苗在我国实际应用中的优势提供理论基础.利用RT-PCR方法分段扩增CTN-1全基因组序列,随后将PCR产物克隆到T载体、测序、拼接,用MegAlign软件比较CTN-1全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组序列的同源性;再以糖蛋白(G)基因为模板,用ClustalX和MEGA4软件进行系统进化分析.测序结果表明CTN-1全基因组序列的长度为11 925nt(GenBank登录号FJ959397),序列分析表明CTN-1为基因I型;CIN-1株全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组之间的同源性是81.5%～93.4%;与美国蝙蝠分离株SHBRV 18的同源性低.仅为81.5%;与新近从中国国内分离的野毒株HN10株的同源性高,达93.4%.系统进化分析结果表明,CTN-1与国内不同地区大多数分离的狂犬病街毒株聚类于同一组内;而我国另一疫苗株aG株与国外疫苗株如Flury、PM、PV、ERA、RC-HL和个别中国街毒株分在另一组内.G基因氨基酸对比也显示CTN-1株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株,结果说明CTN-1株较其他疫苗株病毒更适合制备用于预防中国狂犬病的灭活疫苗.
关键词： CTN-1狂犬病疫苗株 全基因组序列 基因同源性 进化分析 -
蝙蝠圆环病毒BtCV-DS13株的鉴定与全基因组分析
自首次从棕果蝠(Rousettus leschenaultii)中检测到圆环病毒后,不断有研究小组从不同地域的多种蝙蝠体内发现类似病毒.为掌握中国东部沿海蝙蝠圆环病毒的流行病学资料,以浙江省舟山地区采集的大卫鼠耳蝠的肠道组织为模板,采用巢式PCR和染色体步移法相结合的方法获得一株蝙蝠圆环病毒的全基因组序列,并命名为BtCV-DS13.序列分析表明,BtCV-DS13全基因组长度为1 873nt,具有圆环病毒的典型基因组结构特征.同源性比较显示,与已公布的4种蝙蝠来源的圆环病毒(Bat1、Bat2、Bat3)或环病毒代表株(Cyclovirus bat)的同源性均较低,分别为22.9％、53.5％、24.7％和4.5％.系统进化分析显示,BtCV-DS13处于圆环病毒属的一个大分支中,与猪圆环病毒和蝙蝠圆环病毒处于其中同一个小分支.基于以上分析,初步判断BtCV-DS13在分类上是一种新的蝙蝠圆环病毒.
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宠物鸟H3N8亚型流行性感冒病毒NA基因分子特征性分析
虽然流行性感冒(流感)病毒的自然宿主是野生水禽类,作为宠物的雀形目鸟(Passeriformes)不代表流感病毒主要储存库[1-4,6,7],但Stallknecht和Shane 1988年对21 318份鸟的样品分析后发现,雀形目鸟中流感病毒的分离率占2.9%,表明雀形目鸟在流感病毒储存库中起着一定的作用.
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家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒NS基因分析
对长沙市家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)的非结构蛋白(Nonstructural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨污水中H5N1病毒的传播风险.9份家禽市场环境污水H5N1亚型AIV标本进行NS基因TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸(amine acid,aa)比对和进化树分析.共得到8个阳性克隆,进化树构建显示8个H5N1的NS基因均属于A亚群,其编码的NS1和NS2蛋白与A亚群代表株(A/chicken/ Hubei/w h/ 1999)aa同源性分别为90.1％～92.5％和91.0％～92.6％,8个H5N1的NS1和NS2 aa之间的同源性分别为93.8％～100.0％和98.4％～100.0％.8个H5N1的NS1蛋白均具有缺失80～84位aa、C末端携带有ESEV的PL基序和第92位aa为E的高致病性分子特征.家禽市场污水来源的H5N1亚型AIV的NS基因具有高致病性的分子特征,这种基因特征表明污水可能传播H5N1病毒.
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甘肃省2013～2016年手足口病病原学监测分析
本研究对甘肃省2013～2016年手足口病病原监测结果进行分析,以了解甘肃省这几年病原谱的构成,主要病原的流行特点,为进一步做好手足口病防控工作提供依据.2013～2016年,甘肃省监测网络实验室对7 171份标本进行了核酸检测,对其中3373份阳性标本开展了病毒分离培养,对得到的阳性分离株进行全长VP1区核苷酸序列测定及其分子特征分析.检测到核酸阳性标本4 314份,EV71为1 153份,占病原构成的27.73％,CVA16为1 452份,占33.66％,其他肠道病毒为1 709份,占39.62％.重症病例124例,阳性97例,其中EV71为23例,占病原构成的23.71％,CVA16为9例,占9.28％,其他肠道病毒为64例,占65.98％,EV71+CA16混合型为1例,占1.03％;死亡病例2例,均为EV71.2013年以其他肠道病毒为主要病原,占36.76％(347/944);2014年以CVA16为主,占52.83％(625/1 183);2015年和2016年均以其他肠道病毒为主,分别占57.04％(531/931)和48.25％(606/1 256).分离到的病毒株除了EV71和CVA16,其他肠道病毒以CVA6、CVA10和CVA4为主.2013～2016年中,不同年份流行的病原不尽相同,不同地区流行的主要病原也存在地区差异.对流行的几种主要病原的VP1区分析结果表明:C4a基因亚型EV71在甘肃省仍然持续流行;CVA16的流行则是B1b基因亚型占据优势,B1a基因亚型逐渐消失;甘肃省流行的CVA6和CVA10与国内流行的毒株亲缘关系相近,且存在不同的传播链.
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新疆乌拉尔田鼠细环病毒的分析与鉴定
啮齿动物是当前种类多和分布广的哺乳动物,也是重要的人兽共患病原自然宿主之一.新疆作为我国畜牧业大省,啮齿动物种类繁多,鼠害不仅严重破坏该地区牧场,其携带的病毒也对人类健康造成了潜在威胁.掌握新疆啮齿动物携带未知病毒的种类,为防范啮齿动物源人兽共患病提供参考依据.对采集自新疆阿克苏市的12只乌拉尔田鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器进行病毒宏基因组学分析,根据其结果对细环病毒进行了PCR检测和全基因分析.从6只(50％)乌拉尔田鼠的不同脏器中检测到了细环病毒,包括两个基因型(A1和A2),全长为2 220～2 232 nt,编码四个开放阅读框.遗传分析发现该病毒开放阅读框1与英国啮齿动物细环病毒1型同源性高,为80％,而与其它已知指环病毒同源性低于42.3％.依据国际病毒分类委员会新种判断标准,本研究发现的病毒和啮齿动物细环病毒1型同为该病毒科的一个新种,且属于不同的两个亚种,本研究为了解细环病毒自然多样性和进化动态提供了基础数据.
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2013～2015年宁夏地区手足口病柯萨奇病毒A组6型基因特征分析
研究2013～2015年宁夏地区普通手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)病例中柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)分离株基因特征.将2013～2015年收集的普通HFMD病例标本中所有非肠道病毒A71型(enterovirus,71)和非柯萨奇病毒16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)的其它肠道病毒(Enterovirus,EV)核酸阳性标本,使用RD细胞进行病毒分离,获得的毒株使用兼并引物进行VP1区基因扩增和测序,测序结果编辑后通过BLAST比对进行型别鉴定,选择CV-A6毒株进行基因进化分析.2013～2015年共收集非EV71和非CV-A16的EV阳性标本998份,共分离到227株毒株,其中61株鉴定为CV-A6,同源性分析表明宁夏61株CV-A6间核苷酸和氨基酸序列同源性分别是96.1％～99.8％和98％～100％,与Gudla原型株同源性为82％～83.5％和93.8％～95.7％,遗传距离较远.CV-A6成为宁夏地区2013年和2015年其它肠道病毒中导致HFMD的主要病原体与国内流行的CV-A6具有较高的同源性,流行趋势一致,并且在宁夏地区存在多个传播链.
关键词： 手足口病(HFMD) 病原 柯萨奇病毒A组6型(CV-A6) 进化分析 -
一株鸭源禽4型副粘病毒的分离鉴定及遗传进化特征分析
目的 对不明原因死亡的家鸭进行病原鉴定及分离,对其全基因序列进行遗传信息系统发育分析,初步揭示病原的致病性和传播特点,为进一步研究禽4型副粘病毒的致病与传播机制提供科学依据. 方法 采集病死鸭脏器,经处理后接种SPF鸡胚,分离具有血液凝集特性的病原体.通过随机聚合酶链反应,用锚定特异引物对模板进行非特异性扩增.扩增产物经纯化后克隆、测序,登录NCBI数据库进行BLAST比对以确定分离毒株种类;通过Sanger测序技术对病毒进行全基因组测序,采用MEGA7.0软件进行序列比对,通过邻近归并法(Neighbor-Joining)构建种系发生进化树分析其基因特征. 结果 分离到1株血液凝集特性的病原体(SDD01),通过电镜观察、随机聚合酶链反应及测序确定为禽4型副粘病毒.PCR扩增得到其-NP-P M-F-HN-基因全长序列以及L基因的完整CDS区.F基因氨基酸基序分析显示,蛋白切割位点为DVQPR↓F,MDT＞ 144 h,ICPI为0.系统发育分析毒株位于东半球谱系中Ib进化分支,与APMV-4/Mallard/Hubei/2014等野鸟源病毒株同源性为99.4％. 结论 在死亡家鸭脏器中分离到禽4型副粘病毒.该病毒对鸡的致病性较低,系统发育分析其F基因与野鸟源禽4型副粘病毒同源性为99.3％～99.4％,表明家鸭感染的禽4型副粘病毒可能由野鸟引入,并可在家禽和野鸟之间循环传播.
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虎源伪狂犬病毒的鉴定及gB基因分析
目的 对不明原因死亡虎进行病毒感染检测,并对病毒部分保守基因序列进行分析.方法 采集不明原因病死虎肺组织,研磨后提取总DNA,使用特异性引物对伪狂犬病毒gB基因、gD基因进行PCR扩增、测序并构建进化树;经负染法染色后用电子显微镜观察病毒形态结构;取研磨组织液接种家兔,观察病毒的致病力.结果 PCR扩增组织样品为gB基因、gD基因阳性,基因序列经blast比对伪狂犬病毒.将gB基因通过序列测定分析并与GenBank中近4年公布的9株伪狂犬病毒gB基因比对,同源性为99.5％～100％.进化树分析该病毒与2012年北京家猪分离株属同一进化分支.组织研磨液置电镜观察,见病毒呈圆形,直径100 nm左右,有囊膜,为具有典型特征的疱疹病毒样病毒粒子.家兔接种组织研磨液后出现啃咬接种部位,抽搐,嘶叫等伪狂犬病症状.结论 本研究在病死虎体内检测到伪狂犬病毒,表明濒危野生动物虎已受到伪狂犬病毒病的威胁.
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北京市西城区手足口病柯萨奇病毒A5型VP4区基因特征分析
目的 分析2009年北京市西城区手足口病柯萨奇病毒A5型(CoxA5)的VP4区基因特征,了解其变异情况.方法 采集手足口病患儿咽试子,提取病毒RNA,用肠道病毒VP4区分型引物进行半巢式RT-PCR(RT-nPCR),通过测序和GenBank Blast比对确定肠道病毒型别,并对其VP4区进行序列和进化分析. 结果 共鉴定出5株CoxA5,GenBank登录号为JN981017- JN981021.在VP4区,5株CoxA5与中国株HQ728261核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96％～99％和98％～100％.进化分析表明,5株CoxA5与中国株HQ728261遗传距离为0.005～0.045,共同构成一个独立的进化树分支.5株CoxA5在VP4区无氨基酸的缺失和插入,未发现特有的氨基酸置换. 结论 2009年北京市西城区手足口病病原体CoxA5VP4区与中国株HQ728261在进化上密切相关,其序列未发生明显变异.
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2015-2016年贵州省柯萨奇病毒A6型分离株的基因特征分析
目的 分析贵州省柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)分离株的基因特征. 方法 2015-2016年分离自贵州省急性弛缓性麻痹(acute flaccid paralysis,AFP)患者的5株CVA6,采用RT-PCR进行VP1区基因扩增并测序,通过MEGA7.0软件采用邻位相接法(neighbor joining method)构建遗传进化树,分析VP1区基因特征,通过1000bootstrap值评估其可靠性. 结果 5株CVA6贵州分离株之间的的核苷酸与氨基酸同源性分别为94.2％～100％和97.3％～100％,与原型株Gdula株之间的核苷酸同源性与氨基酸分别为81.8％～83.1％,和94.5％～95.7％;5株CVA6均为F基因型,其中1株(MF45512)为F2基因亚型,另外4株为F3基因亚型. 结论 2015-2016年贵州省CVA6流行株为F2和F3基因亚型,以F3基因亚型为主.
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2016年北京地区急性腹泻患儿感染人博卡病毒流行特征及分子进化研究
目的 了解2016年北京地区急性腹泻患儿感染人博卡病毒(HBoV)流行及遗传进化特征. 方法 采集北京地区哨点医院2016年＜60月龄急性腹泻患儿粪便标本,用巢式PCR检测HBoV,通过测序和Blast比对确定病毒型别,并进行遗传进化分析;采用实时荧光PCR对A组轮状病毒、诺如病毒、肠道腺病毒、星状病毒进行检测,分析混合感染情况. 结果 354份粪便标本中,HBoV阳性26份,阳性率为7.34％,其感染无明显季节分布,＜2岁患儿占84.62％.HBoV与其他腹泻病毒混合感染率为38.46％,以混合轮状病毒感染为主.进化分析表明,HBoV1、2、3型感染分别为15、10、1例,未检出HBoV4型.HBoV2序列均独立于HBoV2A和HBoV2B亚型分支,位于一个新的HBoV2亚型分支上. 结论 2016年北京地区腹泻患儿感染HBoV包括3种型别(1-3型),2岁以内患儿是高发人群.HBoV2在进化树上位于一个新的亚型分支.
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2009-2017年河北省廊坊市新甲型H1N1流感病毒基因进化分析
目的 了解2009-2017年河北省廊坊市新甲型H1N1流感流行态势,分析H1N1血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酰酶(neuraminidase,NA)基因变异情况及其遗传进化特征.方法 选定2009-2017年河北省廊坊市分离的甲型H1N1流感毒14株,使经核酸提取和PCR扩增测序HA和NA基因,采用MEGA version 6.0进行对比分析,采用N-J法构建新甲型H1N1流感病毒HA、NA基因进化树. 结果 廊坊市2009-2017年新甲型H1N1流感病毒HA基因序列同源性为97.2％～100.0％,NA基因序列同源性为97.7％～100.0％,HA和NA抗原决定簇、受体结合位点、糖基化位点均未发生变异.随着时间的推移,NA和HA突变位点均呈增多趋势,表明毒株逐年发生变异. 结论 2009-2017年河北省廊坊市新甲型H1N1流感病毒HA和NA基因与国内、国际代表株高度同源,但其编码蛋白氨基酸的序列逐年发生变异,并出现不同程度的变异增强现象,因此应进一步加强对流感的监测.
