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狙击MERS的“青年军团”
近日，复旦大学医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室姜世勃教授团队与美国科学家联合研发了对MERS病毒具有高抑制活性的全人源单克隆抗体(m336)，成为目前针对MERS病毒好的候选治疗药物之一。该团队因此轰动全球传染病学领域，当他们从幕后走到台前时，更令人讶异不已--团队平均年龄仅有32.4岁，其中许多骨干是80后、90后。这支“青年军团”究竟是如何攻克这一国际难题的呢？
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基因工程抗体亲和力成熟研究进展
自 1975 年,Kohler 创建杂交瘤技术并成功制备单克隆抗体以来,人们已研制出数以千计的单克隆抗体.单克隆抗体因其高度的靶向特异性已经成为科学研究,疾病诊断,药物靶向治疗等不可或缺的工具.由于杂交瘤技术制备单克隆抗体为鼠源性,在人体应用时易发生免疫排斥反应,难以有效激发人体免疫效应,而人源的基因工程抗体很好地解决了这一问题.借助 DNA 重组和蛋白质工程技术,人们可以获得人源单克隆抗体,并可在基因水平对抗体进行拼接、修饰、重新组装成为一种新型抗体.
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医药快讯
Secukinumab 用于斑块状银屑病的两项Ⅲ期临床试验取得满意结果
美国诺华（Novartis）公司于2014年3月22日宣布，其药物 Secukinumab（曾用名：AIN457）的两项Ⅲ期临床试验（FEATURE、JUNCTURE）均达复合首要终末指标，可改善中至重度斑块状银屑病。
白细胞介素17A（IL-17A）是一种与斑块状银屑病相关的关键细胞因子，银屑病皮肤斑块处可检测出高浓度。 Secukinumab 为人源单克隆抗体，可选择性与 IL-17A 结合并中和 IL-17A，抑制其促炎性作用。 -
戊型肝炎病毒衣壳蛋白特异性人源单克隆抗体的筛选与鉴定
目的:建立从外周血快速筛选戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)衣壳蛋白特异性人源抗体的方法,从疫苗免疫者外周血中筛选出相应抗体并进行鉴定.方法:采用分选型流式细胞仪获得外周血中HEV衣壳蛋白特异性的记忆B细胞,通过单细胞RT-PCR的方法获得抗体序列,并进行重组表达,后对获得的人源单克隆抗体进行初步性质鉴定.结果:成功筛选到识别HEV衣壳蛋白的6株人源单克隆抗体,6株抗体均具有抗原结合活性,4株抗体具有中和活性.结论:成功获得HEV衣壳蛋白特异性人源单克隆抗体序列,并进行真核表达,对抗体的性质进行初步鉴定,为后期研究疫苗免疫的人体内的抗体演化打下基础.
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人源抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性和预防治疗作用
目的考察人源抗破伤风毒素单克隆抗体的中和活性及体内预防治疗作用.方法对分泌人源抗破伤风毒素单克隆抗体(人源单抗)的两株细胞进行培养,并对其抗体进行纯化及检定.结果人源单抗在小鼠体外具有中和活性.较高的剂量可完全中和毒素,延长小鼠生存时间.不同的人源单抗中和活性不同.单抗在小鼠攻毒实验中均具有一定的预防和治疗作用.结论人源单抗可用于破伤风感染的预防治疗.
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丙型肝炎病毒人源单克隆抗体的初步筛选
目的 构建天然人源噬菌体抗体库,初步筛选人源抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)多肽抗原的单克隆重组噬菌体抗体.方法 以健康成人外周血淋巴细胞cDNA为模板,采用PCR技术扩增轻(VL)、重链(VH)可变区基因;重叠PCR法拼接生成单链抗体可变区基因片段(single chain fragment variable,scFv),并克隆至噬菌体载体pCANTAB5e,得到初级抗体库;使用HCV多肽混合抗原,经3轮淘筛富集噬菌体抗体;Phage ELISA法初步筛选HCV重组噬菌体抗体.结果 成功构建了天然人源噬菌体抗体库.scFv(VH-κ)库的库容为6.0×107 PFU/mL,scFv(VH-λ)库的库容为4.28×109 PFU/mL;经初步淘筛,成功获得HCV三级抗体库;Phage ELISA得到了3株候选重组噬菌体抗体.结论 初步得到HCV多肽抗原重组噬菌体抗体,为今后进一步筛选高亲和力噬菌体抗体和可溶抗体奠定了基础.
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全人源单克隆抗体现状及发展趋势(续)
4 技术平台全人源单抗是抗体工程技术发展的重要趋势.目前全人源单抗的研发技术主要有:B细胞永生化技术、噬菌体抗体库技术、转基因小鼠技术以及人源杂交瘤技术等.其中以噬菌体展示技术和转基因小鼠技术实际应用广泛、成功.
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全人源单克隆抗体现状及发展趋势
单克隆抗体(单抗)是继疫苗、重组蛋白后重要的一类生物技术产品,是21世纪生物技术和生物医药产业领域的战略制高点.单抗已成功应用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等.单抗技术经过35年的发展,历经鼠源性(murine)、嵌合(chimeric)、人源化(humanized)和全人源单抗(human monoclonal antibody)四个阶段[1-2].
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人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达
用常规RT-PCR法,直接从5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因,构建噬菌体抗体Fab库.对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体.5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达96%.对一阳性克隆在大肠杆菌中表达,经ELISA及Westernblot分析鉴定,证实成功表达出人源可溶性Fab.对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定,证实所获基因为抗体可变区基因.抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具.
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DNA标记杂交技术筛选抗HBs-IFN-α融合蛋白表达载体
为在无抗药性改变,转化细胞无生物指示系统改变的克隆载体中扩大筛选范围,提高筛选阳性率,本文应用地高辛标记DNA检测系统筛选人源单抗片段与干扰素融合蛋白表达质粒(Anti-HBs-IFN-α),取得了理想的效果.纯化制备载体的插入段DNA,用地高辛标记系统进行化学标记,制成标记探针.挑取单克隆菌扩增,以溶菌酶加煮沸法批量制备载体DNA,点样于硝酸纤维膜上并经80℃烤2h,分别用预杂交液和标记探针进行42℃2h、42℃6h的膜预杂交和杂交反应,洗膜后用酶标抗地高辛抗体显色.未带插入片段的抗体表达载体为阴性对照,IFN-α质粒DNA作阳性对照,在40株转化细胞中筛选出7个目的克隆.为进一步核实该法的筛选效率和可靠性,分别用单酶切和双酶切法对筛选出的阳性载体进行鉴定,琼脂糖电泳结果显示,两者的符合率为100%.该系统筛选结果可靠,尤其在克隆载体转化细胞后无抗药改变,无其他筛选特征的载体构建中有一定的优势.
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抗呼吸道合胞体病毒感染的人源单克隆抗体——Motavizumab
呼吸道合胞体病毒(RSV)是诱发婴幼儿及儿童病毒性细支气管炎和肺炎的主要病原体,为有包膜RNA病毒,主要入侵呼吸道上皮细胞.病毒包膜F糖蛋白介导包膜与宿主细胞膜的融合,被感染细胞随之也发生融合,终形成合胞体.不同RSV株的F蛋白序列类似,故而F蛋白可作为治疗靶标.RSV感染性疾病的症状直接由病毒性细胞病变以及对感染的宿主反应所引起.病毒复制与对RSV感染的超常的免疫应答紧密相关,而研究表明,RSV所诱发的细胞因子产生的方式影响病毒复制与宿主免疫应答之间的平衡,这终决定了疾病的表现形式.约有70%的婴儿在出生后1年内以及几乎所有儿童在2岁时均会感染RSV, 而早产儿和患有慢性肺病或先心病的患者罹患严重RSV感染性疾病的风险率高,常需住院治疗,其他高危人群包括老年人、有潜在呼吸系统疾病或心脏疾病者以及免疫力低下者.采用反向遗传学或载体疫苗技术开发的RSV减毒活疫苗有望能控制RSV感染.
关键词： motavizumab 人源单克隆抗体 呼吸道合胞体病毒 -
用于自身免疫性疾病的单克隆抗体——贝利单抗
贝利单抗(LymphoStat-B(R))是一种人源单克隆抗体,能键合并中和可溶性B-细胞活化因子(BAFF).BAFF也被称为BLyS(B-淋巴细胞刺激因子)、THANK[可激活细胞凋亡、核因子-κB和c-Jun N-末端激酶的肿瘤坏死因子(TNF)同系物]、TALL-1(与TNF和ApoL相关的白细胞表达的配体-1)、TNFSF13B(TNF超家族中的成员13b)或zTNF4.BAFF主要通过骨髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞)分泌,在B-细胞成熟、存活以及免疫球蛋白转化重组过程和T-细胞共刺激方面发挥着作用.在自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、Sj(o)gren's综合征及B-淋巴肿瘤患者的血浆中,BAFF水平提高.
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用强化接种后的特殊PBMC和改良永生化技术制备人源抗HBs
目的 建立乙肝表面抗体(抗HBs)阳性者EBV永生化的B淋巴母细胞系(B-LCLs),筛选、获得人源抗HBs及其分泌细胞.方法 常规技术获得乙肝疫苗强化免疫后志愿者的特异性外周血单核细胞(PBMC),EBV转染,加入CpGDNA免疫调节基序诱导B淋巴细胞增殖,环孢菌素A(CyA)抑制T淋巴细胞活性.雅培法定量动态检测水生化细胞培养上清中的抗HBs滴度,取高滴度抗HBs孔的B-LCLs细胞有限稀释法培养.用免疫组化SP法观察细胞分化状况及抗HBs表达.结果 成功构建了分泌抗HBs的永生化.B-LCLs;培养上清抗HBs滴度维持较高水平3周左右,之后逐渐降低;免疫组化鉴定B-LCLs细胞培养3个月时,永生化细胞仍然为抗HBs合成细胞.结论 采用改进的EBV永生化技术转化强化接种后获得的特殊PBMC,可高效获得永生化的B-LCLs,并有效表达抗HBs.
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噬菌体展示技术在阿尔茨海默病中的应用
自1985年Smith GP[1]首次建立了噬菌体展示技术(Phage display),近十几年来,该技术的研究进展非常迅速,在肿瘤、病毒性疾病和一些神经退行性疾病的抗原决定簇的定位、人源单克隆抗体的制备、药物筛选、疫苗研制以及疾病诊断、治疗等研究领域都得到广泛的应用[2].
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人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选
目的构建人丙型肝炎病毒(HCV)特异性噬菌体抗体库,制备人源抗HCV单克隆抗体(mAb).方法用常规RT PCR法,直接从5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中,扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因,与噬菌体载体pComb3连接,构建噬菌体抗体Fab库.对抗体库进行5轮吸附-洗脱-扩增的亲和选择后,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体.结果RT PCR可有效地扩增出Fd和κ基因,并以此构建成容量为1.2×107的噬菌体抗体库.经5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达96%.结论抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具.
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炎症性肠病的实验性免疫调节治疗
克隆病和溃疡性结肠炎均属慢性炎症性肠病,两种疾病的病因不明,但是可从典型的临床表现,内镜下的改变或组织学特点加以区分.两种疾病均为粘膜炎症,其免疫学以促炎性反应的细胞因子过度表达为特征.克隆病的临床表现并不是单一性的,可以在不同个体中形成诸如瘘管或狭窄等特征性改变,因此以临床表现推测同一疾病可分为不同亚类,它们在病理生理及对治疗的反应等方面截然不同.随着公认的免疫干预措施的出现,人们开展了靶向治疗并对疗效进行评价.TNF-a为一种促炎症性细胞因子,在炎症反应的免疫调节中起重要作用,人源单克隆抗体经基因工程改造后与TNF-a有较高的亲和性.虽然该抗体发挥作用的确切机制并不清楚,但是一次静注此单抗(cA2)即可大大降低类因醇依赖的慢性活动性克隆病患者的百分比.IL-10做为一种抗炎症反应的细胞因子,可以下调大多数免疫细胞和非免疫细胞的免疫活性,肠外给予IL-10可改善克隆病患者的生活质量.有研究表明,静脉应用IL-10疗效较好,而皮下给药效果不佳.人们正在研究新的治疗方案,其中一种方案就是应用反义核酸技术.具有特定化学结构的反义核酸能够穿透细胞中和靶分子中与之互补的正义mRNA,特异性抑制了靶分子在转录水平的表达.有关IBD免疫治疗方面的研究进展不仅为IBD提供了较好的治疗模式,从新的角度阐明了炎症反应的病理生理基础.
