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RNA干扰技术抑制诱导型一氧化氮合酶基因表达对大鼠胰岛细胞凋亡和功能的影响
目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因在大鼠胰岛细胞培养过程中对胰岛细胞凋亡和胰岛素分泌的影响及其机制.方法 从30只Wistar大鼠获得胰岛,随机分为5组.大鼠胰岛体外培养中,使用针对iNOS的siRNA转染胰岛.根据RNA干扰(RNAi)条件以及培养液中是否加入细胞因子TNF-α和IL-1β将胰岛分为5组:空白对照组、细胞因子组、阴性对照组、RNAi组以及RNAi+细胞因子组.通过RT-PCR和Western blot检测RNAi效果,RT-PCR和TUNNEL法检测胰岛凋亡情况,胰岛素释放实验检测胰岛功能.结果 每只大鼠可获得500～600 IEQ胰岛.RNAi可以沉默大鼠胰岛组织iNOS基因,抑制iNOS生成.胰岛经细胞因子IL-1β和TNF-α处理后,促凋亡基因Bax和Fas表达明显升高,胰岛素释放减少.经RNAi抑制iNOS基因后,胰岛与细胞因子IL-1β和TNF-α共同培养时,促凋亡基因表达明显下降,凋亡细胞减少,胰岛素释放增加.结论 RNAi技术抑制胰岛iNOS基因表达后,可减少胰岛细胞凋亡,改善胰岛的存活和功能.
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体内诱导胰岛血红素加氧酶-1过表达对异种胰岛移植物的保护作用
胞浸润数量明显少于其他两组(P<0.05).结论 CoPP诱导HO-1过表达可延长异种胰岛移植物存活,其机制可能与IL-10免疫调节有关.
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基因转移CTLA4-Ig和抗CD154抗体在异种胰岛移植排斥反应中的作用
目的 探讨基因转移细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)和抗T细胞分化群154(CD154)抗体在异种胰岛移植排斥反应中的作用及机理.方法 建立人-大鼠异种胰岛移植模型,用携带CTLA4-Ig基因的重组腺病毒感染移植胰岛细胞,并用抗CD154抗体进行治疗,观察糖尿病大鼠胰岛移植后血糖变化、生存情况及移植物病理形态学改变,检测移植物CTLA4-Ig、胰岛素的表达和移植大鼠白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平变化.结果 (1)糖尿病大鼠移植后2 d血糖降至正常,对照组血糖平均在移植后8 d升高,抗体治疗组、转染组和联合治疗组血糖分别在18、25和36 d升高.(2)对照组、抗体治疗组、转染组和联合治疗组的移植物存活时间分别为(10.0±2.1)d、(22.0±8.2)d、(28.0±6.5)d和(37.0±9.3)d,各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);移植大鼠生存时间分别为(21.0±5.7)d、(35.0±6.5)d、(48.0±8.5)d和(65.0 ±12.5)d,各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).(3)对照组在移植后1周内,IL-2、TNF-α的水平均急剧上升,较移植前显著升高(P＜0.01).(4)各治疗组移植物见成片的胰岛细胞团,未见淋巴细胞浸润,转染组和联合治疗组移植物可见CTLA4-Ig和胰岛素的表达.结论 基因转移CTLA4-Ig和抗CD154抗体均可抑制异种胰岛移植排斥反应,二者联合效果优于单独使用.
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成人胰岛分离纯化技术
目前,胰岛移植已经成为治疗糖尿病的有效手段之一.从供者胰腺中分离出大量高活力的胰岛是保证胰岛移植成功的必要环节.本研究自2005年3月至2008年1月共进行15例成人胰岛分离纯化,现总结如下.
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Fas配体阳性睾丸细胞和环孢素A对移植胰岛细胞存活起协同保护作用
目的探讨Fas配体(Fas L)阳性睾丸细胞与胰岛细胞共移植后联用环孢素A(CsA)对移植胰岛细胞存活的协同保护作用. 方法将同种大鼠胰岛细胞与睾丸Sertoli细胞同侧或异侧共移植于41只糖尿病SD大鼠受体肾包膜下.实验大鼠分7组,术后酌用CsA,观察各组大鼠移植物存活情况. 结果单纯胰岛细胞移植(对照组)后胰岛细胞的平均存活期为(4.6±1.1)d,加用CsA存活期明显延长至(21.8±4.7)d(P<0.01).与1×107个睾丸细胞同侧共移植的胰岛细胞平均存活期超过(57.5±4.0)d,但如移植前先封闭睾丸细胞表达的FasL后,移植的胰岛细胞平均存活期缩短为(5.8±2.6)d.胰岛细胞与1×105个睾丸细胞分别共移植于两侧肾包膜下,术后联用CsA,胰岛细胞的平均存活期超过(55.0±6.5)d,与1×107个睾丸细胞同侧共移植的存活期相近,但比对照组或CsA组则显著延长(P<0.01).当胰岛细胞与1×106个睾丸细胞分别共移植且不用CsA时,胰岛细胞存活期平均仅为(11.5±3.1)d,但仍较对照组延长(P<0.05). 结论表达FasL的睾丸细胞与CsA联用后可通过不同机制抑制胰岛细胞移植排斥反应而起到全身的协保护作用.
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Fas配体表达对同种胰岛移植的影响
目的探究睾丸细胞FasL表达能否对共移植的胰岛移植物提供免疫豁免作用以及胰岛细胞FasL基因转染对同种胰岛移植的影响. 方法将同种大鼠胰岛及睾丸细胞同时移植于糖尿病受体,重组腺病毒AdV-FasL感染胰岛细胞后移植,观察移植物存活情况、胰岛功能,并检测移植物内浸润淋巴细胞以及基因转染胰岛细胞凋亡情况. 结果单纯移植胰岛组平均存活期为(6.3±0.56)?d.与胰岛细胞同时移植的睾丸细胞数增加至1×107时,存活期大于50?d(P＜0.05).表达FasL的睾丸细胞在移植物内诱导浸润淋巴细胞凋亡.FasL基因转染组出现排斥加速,存活期缩短至(3.4±0.24)?d.FasL转染的胰岛细胞在移植后24 h见FasL表达,48 h表达增强,移植后FasL转染胰岛细胞凋亡. 结论表达FasL的睾丸细胞与胰岛同时移植可诱导活化的淋巴细胞凋亡,使胰岛移植物获得免疫豁免、存活期延长,但通过FasL基因转染使胰岛细胞直接表达FasL引起胰岛细胞凋亡和粒细胞浸润,导致排斥加速.
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机械化分离成人胰岛的研究
分离出高数量、高活性的胰岛是保障成人胰岛移植成功的关键环节[1].目前广泛采用的纯手工方法进行成人胰岛的分离与纯化所获得的胰岛并不能达到临床移植的要求.本实验通过采用机械化方法成功地进行了8例成人胰岛的分离、纯化,并显著提高了成人胰岛质量,为下一步运用于胰岛临床移植提供了有力的保障.
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成人胰岛大容量分离技术的改进及胰岛功能检测
目的通过对人胰岛分离技术的改进以获得大量高活力胰岛并检测其功能,为利用同种异体胰岛移植治疗1型和部分2型糖尿病提供理论依据和技术基础.方法采用改良的自动分离技术连续分离28例人胰岛,然后用连续性密度样度离心法纯化胰岛.胰岛收获量以国际标准的胰岛当量(islet equivalent,IEQ)表示.胰岛功能的测定分别为体外测定胰岛的胰岛素/DNA比率;静止葡萄糖刺激试验(SGS)及将胰岛移植至糖尿病裸小鼠的体内胰岛功能鉴定并随后进行腹腔糖耐量试验,连续测定移植鼠血糖水平及其体内C肽浓度.结果28例成人胰腺分离的胰岛收获量为5 000～1 030 000 IEQ/胰腺,平均为291 635 IEQ/胰腺,前13例平均每个胰腺收获49 123 IEQ,平均每克组织收获846 IEQ,平均纯度为87%,随着技术的改进后15例的分离结果则分别为:平均每个胰腺501813 IEQ,平均每克组织7 003 IEQ,平均纯度89%.体外胰岛素刺激试验结果表明分离纯化后的人胰岛有正常功能,将12次分离得到的胰岛分别移植至34只糖尿病裸鼠肾包膜下,其中29只糖尿病裸鼠于12 h内血糖恢复正常且糖耐量试验接近正常鼠,血中C肽水平亦接近正常鼠.结论采用改进的人胰岛分离方法,可以获得大量高活力的具有正常功能的胰岛,为同种异体胰岛移植用于临床奠定了必要的实验基础.
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胰岛移植治疗1型糖尿病的进展与挑战
随着外科移植技术的发展和胰岛分离纯化技术的改进,胰岛移植已成为治疗糖尿病的理想方法和手段.本文就目前胰岛移植治疗1型糖尿病的临床效果评价情况、面临的主要问题和解决方法,以及胰岛移植相关研究的进展与挑战展开述评.
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胰岛移植和胰岛干细胞研究现状
近年来,糖尿病患病率在全球呈现快速增长的趋势,我国人口患病率已接近5%,与发达国家类似.糖尿病已经成为患者和社会的巨大负担.目前,几乎所有1型糖尿病和部分胰岛素依赖的2型糖尿病患者都需要应用外源性胰岛素注射来控制血糖.严格控制血糖不能保证血糖稳定,亦不能避免远期并发症的发生[1],同时可能导致低血糖晕厥发作相对增多.
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胰腺移植与胰岛移植比较及展望
近些年,糖尿病在世界范围内受到越来越广泛的关注,其发病率不断增加,给病人及其家庭带来沉重的负担,大约30-50%的糖尿病病人合并各种并发症,进而导致生活质量下降,生存期缩短.糖尿病病人持续的高血糖水平是合并并发症的决定性危险因素.因此,只有建立安全有效的治疗方案,长期维持正常的血糖水平,才能给糖尿病病人带来健康、良好的生活.DCCT指出,即使是严格遵守糖尿病的强化治疗方案,也难以长期维持血糖稳定,且增加发生低血糖无感知等严重并发症的发生率.
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永远缅怀王吉甫教授
中国现代胃肠外科学奠基人之一，原中华医学会外科学分会胃肠外科学组组长，全国胰岛移植研究会副会长，原广东医学会外科学分会主任委员，《中华胃肠外科杂志》创始人，《消化肿瘤杂志（电子版）》总顾问，我国著名胃肠外科专家，中山大学附属第一医院外科教授，享受国务院政府特殊津贴专家，广东省外科终身成就奖得主，博士生导师王吉甫教授，因病于2016年2月12日上午10时02分在广州中山大学附属第一医院逝世，享年88岁。
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间充质干细胞联合骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受的研究
目的 观察间充质干细胞(MSC)联合骨髓细胞(BMC)输注对同种异体小鼠胰岛移植嵌合状态及胰岛移植物存活时间的影响.方法 C57BL/6小鼠和BALB/C小鼠分别作为供、受体.应用链脲佐菌素制备BALB/C小鼠糖尿病模型,将分离纯化的C57BL/6小鼠胰岛移植到上述糖尿病模型小鼠的肾包囊下,用抗CD154单抗进行受体预处理.将接受胰岛移植的25只BALB/C受体鼠随机分为A组(单纯胰岛移植);B组(供体MSC悬液0.5ml输注);C组(供体BMC悬液0.5ml输注);D组(供体BMC和MSC各0.5ml输注);E组(供体BMC和第三品系的KM小鼠MSC各0.5ml输注),每组5只,所有细胞在胰岛移植后经尾静脉输注.比较以上各组供体细胞嵌合率(DC)和胰岛移植物存活时间的差异.结果 在胰岛移植后第30天,MSC联合BMC输注的D、E两组与单纯BMC输注的C组比较,其DC显著升高(P<0.01);胰岛存活时间亦显著延长[(77.0±7.7d)和(61.0±2.2d)vs(53.0±16.4d)(P<0.01)].胰岛移植后第60天,D组与E组比较,DC维持在更高水平,且胰岛移植物存活时间更长(P<0.05).结论 MSC联合BMC输注比单纯BMC输注能够维持更长时间的混合嵌合状态,并延长胰岛移植物存活时间;供体来源的MSC输注比非供体来源的MSC输注更有效.
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免疫抑制剂对人胰岛细胞的毒性作用
目的 探讨临床常用免疫抑制剂对人胰岛细胞的直接毒性作用.方法 应用体外分离纯化后培养的人胰岛细胞,以刺激系数和丫啶橙/碘丙啶染色为效应指标,检验低、中、高不同浓度免疫抑制剂对人胰岛细胞的直接毒性作用.结果 体外培养3天后,低浓度免疫抑制剂未表现出胰岛毒性作用;中浓度免疫抑制剂对胰岛的毒性不同,以他克莫司为重;高浓度免疫抑制剂有较强的胰岛毒性.结论 免疫抑制剂对人胰岛细胞直接毒性作用与浓度相关,选择低胰岛毒性免疫抑制方案有助于提高胰岛移植成功率.
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供体凋亡脾细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的研究
目的 探讨供体凋亡细胞输注诱导大鼠胰岛移植免疫耐受的可行性.方法 应用链脲佐菌素(STZ)制备SD大鼠糖尿病模型,以直线加速器照射诱导供体Wistar大鼠脾细胞凋亡.将糖尿病SD大鼠分为4组,分别经阴茎背静脉输注Hanks液、供体正常脾细胞、供体凋亡脾细胞、供体坏死脾细胞,7天后于肾包囊进行同种异体胰岛移植,测定血糖变化,观测胰岛移植物存活时间,并通过混合淋巴细胞反应(MLR)观察移植耐受的状态.结果 预输注供体凋亡脾细胞能显著延长同种异体胰岛移植物存活时间(中位存活时间达31天),并使受体鼠对供体鼠的MLR明显减弱.结论 供体凋亡细胞输注能够诱导同种异体大鼠胰岛移植免疫耐受.
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Bcl-2基因转染胰岛细胞移植的实验研究
目的 探讨Bcl-2基因转染胰岛细胞同种移植治疗糖尿病大鼠的效果.方法 腺病毒介导胰岛细胞的Bcl-2基因转染,以表达Bcl-2的胰岛细胞经门静脉肝内移植治疗链脲菌素诱导的糖尿病大鼠.通过观察受体大鼠的血糖变化和组织学改变来了解排斥反应和移植物的功能.结果 胰岛细胞植入后48h内,基因转染组和未转染组糖尿病大鼠血糖均有明显下降.与未转染组比较,基因转染组大鼠移植物存活有效时间明显延长(16.4±4.3天 vs 6.8±2.2天, P＜0.05),移植部位可见到结构和功能完好的胰岛细胞,局部炎性反应也明显减轻.结论胰岛细胞的Bcl-2基因转染对移植物的存活和功能有保护作用.
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海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病的实验研究
采用Sun海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊制作技术,分别包裹大鼠胰岛和胰岛素分泌细胞系,移植于糖尿病小鼠腹腔.结果表明APA微囊化大鼠胰岛或胰岛素分泌细胞移植,均可使糖尿病小鼠血糖降低至接近正常水平达3周至110天;移植微囊无明显的组织学反应.证明该APA微囊化胰岛细胞移植具有较好的治疗效果,微囊具有较好的生物相容性和免疫隔离作用.为进一步发展生物型人工胰岛奠定了基础.
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经肝动脉移植新生猪胰岛细胞治疗Ⅰ型糖尿病的初步报告
目的探讨异种胰岛细胞肝内移植临床应用的可行性,了解猪胰岛细胞植入糖尿病病人肝内以后是否可控制病人血糖,了解移植后可能发生的并发症.方法培养7～10 d的新生猪胰岛细胞,经肝动脉植入4例Ⅰ型糖尿病病人肝内;其中2例植入4×106个胰岛细胞,2例植入8×106个胰岛细胞.移植后病人使用的抗排斥方案为:术后当天,使用甲泼尼龙500 mg,第2天将甲泼尼龙降至50 mg,3 d后服用泼尼松并逐步减量至10 mg,维持该剂量1个月;环孢素 8 mg/kg,每日2次,使用12个月;霉酚酸酯2 g/d,使用25 d.测量移植前后外源性胰岛素用量、葡萄糖耐量试验、血糖以及糖化血红蛋白.观察病人一般情况及肝、肾功能变化.结果由于使用甲泼尼龙的原因,移植后病人的外源性胰岛素用量一度上升至60 mg.随着甲泼尼龙用量的减少,外源性胰岛素的用量逐渐减少,较移植前减量约32%～58%.胰岛素减量幅度与植入胰岛细胞数量相关.移植以后糖尿病病人糖化血红蛋白减少,血糖较移植前明显稳定,肝肾功能维持正常,病人体重增加,一般情况改善.移植异种胰岛细胞以后未发现肝功能和外周血CD4阳性淋巴细胞和CD8阳性淋巴细胞异常.结论经肝动脉移植猪胰岛细胞治疗Ⅰ型糖尿病是安全、有效的治疗方法.所使用的抗免疫排斥方案可以有效地控制移植后的排斥反应.
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模拟微重力条件下大鼠胰岛培养及体内移植的实验研究
目的 研究经模拟微重力条件培养的胰岛是否能够降低胰岛移植过程中引发的免疫排斥反应,进而延长胰岛的体内存活时间.方法 分离新鲜胰岛,应用培养皿对胰岛进行静态培养,同时应用旋转式生物反应器对胰岛进行三维立体培养.应用吖啶橙-碘化丙啶(AO-PI)染色和葡萄糖刺激实验对3种条件下培养得到的胰岛进行生物学活性研究.2000当量胰岛在旋转式生物反应器中培养5 d后,将其移植入经链脲佐菌素(STZ)处理的糖尿病模型SD大鼠肾被膜下作为实验组,以新鲜分离的胰岛和静态培养5 d的胰岛移植入经STZ处理的糖尿病模型SD大鼠肾被膜下作为对照组.在不同时间点上,检测各组SD大鼠血糖变化情况;对各移植组中大鼠进行糖耐受实验.切除肾被膜下的移植物组织作为标本,进行苏木精-伊红(HE)染色及胰岛素组织化学染色检测.结果 体外检测结果表明,与新鲜分离的胰岛和静态培养的胰岛相比,微重力条件下培养的胰岛仍保持良好的胰岛素合成及分泌功能.体内实验表明,微重力条件下培养的胰岛体内移植组的血糖保持正常的时间明显高于接受静态培养的胰岛和新鲜分离的胰岛移植组.将微重力培养条件下胰岛移植大鼠后,取肾被膜下移植区组织标本进行HE染色,未见明显淋巴细胞浸润,胰岛素免疫组织化学均可见阳性细胞.而新分离的胰岛以及静态培养的胰岛移植后,大鼠肾被膜下移植物组织标本可见淋巴细胞浸润,移植物的厚度明显变小.结论 胰岛在微重力条件下培养可降低移植引起的免疫排斥反应,进而延长移植物体内存活时间.
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小鼠胰岛细胞分离纯化及左肾包膜下移植
本试验采用小鼠逆胆总管胶原酶灌注法分离胰岛,移植到同种异体受体小鼠左肾包膜下,为此类研究建立动物模型.
