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中医药诱导干细胞向神经样细胞分化的研究进展
神经干细胞可由多胚层原始细胞分化而来,可自我更新、增殖并能分化为神经系统大部分类型细胞.近年来,中医药介入神经细胞研究作用于微环境和细胞本身,在多靶点、多环节产生效应,诱导神经细胞的生成及增殖分化.本文就近年来中医药诱导间质干细胞生成神经细胞和影响神经细胞的增殖及分化两方面做一综述.
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参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞损伤的影响
目的探讨参麦注射液对缺氧/缺糖/复氧诱导神经细胞凋亡及胞浆内游离钙的影响,阐明参麦注射液治疗缺血性中风急性期的脑保护作用机制.方法用孕17～18 d的SD胎鼠大脑皮层作原代神经细胞培养,制作缺氧/缺糖/复氧致神经细胞损伤模型,采用AnnexinV/PI双染色法以流式细胞仪定量分析神经细胞凋亡率;FIuo-3负载,流式细胞仪定量分析胞浆内游离钙的变化.结果参麦注射液能降低缺氧/缺糖/复氧原代培养神经细胞的凋亡率和胞浆内游离钙浓度.结论参麦注射液治疗急性缺血性中风的疗效机制与提高神经细胞耐缺血缺氧能力,抑制细胞内钙超载,从而减轻凋亡有关.
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川芎嗪对急性脑梗死患者MDA、SOD及红细胞流变性的影响
脑梗死为临床常见疾病,具有较高的病死率、致残率及复发率.已知机体代谢过程中所产生的自由基及其脂质过氧化作用参与了脑缺血后神经细胞的损害.自由基可引起红细胞的脂质过氧化损伤,使细胞变形性降低和细胞膜结构破坏,引起红细胞聚集性增强,导致血液流变性的异常[1].
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三七总皂苷抗缺氧缺糖再给氧诱导大鼠海马神经细胞凋亡的研究
目的:以原代培养的大鼠海马神经细胞缺氧/缺糖再给氧为模型,观察三七总皂苷对神经细胞凋亡的抑制作用.方法:流式细胞仪检测凋亡细胞百分率,激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内Ca2+浓度,荧光显微镜观察细胞形态学变化和坏死细胞百分率,同时,测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放.结果:神经细胞缺氧/缺糖5 h 后再给氧可诱导神经细胞凋亡和细胞坏死,并显著增加细胞内Ca2+浓度和LDH 的释放,并随再给氧时间的延长而增加.三七总皂苷能降低神经细胞凋亡及坏死的百分率,降低细胞内Ca2+ 浓度,减少LDH的释放,三七总皂苷的作用随剂量增加而作用增强.结论:三七总皂苷对缺血再灌注损伤后海马神经元的凋亡过程具有抑制作用,这种作用可能与其能降低细胞内Ca2+ 浓度有关.
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水翁花对微粒体和神经细胞氧化损伤的保护作用
目的:研究水翁花对小鼠肝微粒体膜脂氧化及H2O2诱导的PC12神经细胞氧化损伤的保护作用.方法:用小鼠肝微粒体膜脂氧化模型、细胞培养MTT法测定细胞的存活率等方法.结果:水翁花水提物能强烈抑制小鼠肝微粒体膜脂氧化,IC50为0.013 g·L-1,效果优于阳性对照维他命E(IC50为0.064 g·L-1);对H2O2引起的PC12神经细胞氧化损伤亦显示出较强的抑制作用,对神经细胞表现出保护作用.结论:水翁花对膜脂氧化及神经细胞的氧化损伤的保护作用,可能用于治疗与氧化损伤有关的脑疾.
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天麻素对大鼠皮层缺氧神经细胞NR1亚基mRNA表达的影响
目的:观察天麻素对体外培养大鼠皮层缺氧神经细胞N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR1亚基mRNA表达的影响,探讨天麻素在神经保护方面的可能作用机制.方法:体外培养大鼠胚胎皮层神经细胞,以缺氧无糖培养建立神经细胞损伤模型,采用不同质量浓度的天麻素(13,26,52 mg·L-1)处理细胞,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测神经细胞NR1 mRNA的表达.结果:神经细胞缺氧损伤后,NR1 mRNA的表达显著增高;加入不同质量浓度的天麻素后均能显著降低神经细胞NRI mRNA的表达.其中以26,52 mg·L-1的抑制作用佳.结论:天麻素可能通过拮抗由缺氧引起的神经细胞NMDA受体NR1亚基mRNA表达的增加,发挥其神经保护作用.
关键词： 天麻素 神经细胞 缺氧 NR1 mRNA 反转录聚合酶链式反应 -
清开灵注射液对缺氧/缺糖再给氧损伤时神经细胞线粒体膜电位的保护作用
目的:以缺氧/缺糖再给氧为模型,观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用.方法:四唑盐比色实验(MTT)检测细胞线粒体活性,激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内游离钙离子含量([Ca2+]i),流式细胞术检测细胞凋亡百分率和线粒体膜电位.结果:缺氧-缺糖5 h再给氧3 h时,细胞内[Ca2+]i和细胞凋亡率明显增加,并随再给氧时间的延长而明显增高,线粒体膜电位和活性明显降低,并随再给氧时间的延长而进一步下降,清开灵注射液能显著降低细胞内[Ca2+]i浓度,抑制细胞凋亡的发生,提高线粒体膜电位和活性,与缺氧-缺糖再给氧组相比均有显著性差异(P<0.05,<0.01).结论:清开灵注射液可抑制缺氧-缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低,从而具有稳定线粒体膜电位的作用,抑制细胞凋亡的发生,而对海马神经细胞起到保护作用,这种作用可能与其能抑制神经细胞内钙超载有关.
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天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究
目的:探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的影响.方法:通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin).结果:大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.天麻诱导2h后大部分可分化为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性.结论:大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞.
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补肾活血方对缺血再灌注脑损伤小鼠学习记忆功能及海马神经细胞凋亡的影响
目的:观察补肾活血方对缺血再灌注脑损伤小鼠学习记忆功能及海马神经细胞凋亡的影响.方法:采用双侧颈总动脉夹闭反复缺血再灌术,建立脑缺血学习记忆障碍及海马神经细胞凋亡小鼠模型.以Morris水迷宫测试小鼠学习记忆功能;HE及尼氏染色光镜观察皮层及海马病理形态改变;碘化丙啶(PI)与Hoechst 33342及流式细胞仪检测凋亡细胞,与阿尼西坦及灯盏花注射液对照,观察小鼠学习记忆功能及海马神经细胞凋亡的变化及补肾活血方对其影响.结果:模型组小鼠记忆能力潜伏期较正常对照组及假手术组延长(P＜0.05);皮层及海马神经细胞出现退化、变性、坏死等病理改变;海马神经细胞凋亡百分率升高,术后6h达到高峰(P＜0.01).补肾活血方能缩短小鼠潜伏期(P＜0.05);降低海马神经细胞凋亡百分率,与模型组比较,差异有显著性(P＜0.05).结论:补肾活血方具有改善缺血再灌注脑损伤小鼠学习记忆功能及减轻缺血再灌注后海马神经细胞凋亡的作用.
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黄芩甙拮抗大鼠神经元和星形胶质细胞氧应激损伤
目的探索过氧化氢(H2O2)致星形胶质细胞损伤的实验条件,研究黄芩甙对大鼠神经元和星形胶质细胞氧应激损伤的保护作用.方法体外培养大鼠前脑星形胶质细胞和神经元,分别应用H2O2、黄芩甙及两者联用处理,应用MTT分析法测定细胞活力或存活率.结果不同浓度H2O2对星形胶质细胞存活率的影响各组间差异有显著性(F＝28.569,P＜0.01).同一浓度的H2O2对不同接种密度细胞的损伤程度不同(F＝5.439,P＜0.01).在2.5～40μmol/L浓度范围内,黄芩甙不影响各组神经元和星形胶质细胞的存活率(神经元,F＝0.49,P＞0.05;星形胶质细胞,F＝1.001,P＞0.05).但黄芩甙对H2O2所致神经元和星形胶质细胞氧应激损伤有拮抗作用(神经元,F＝24.384,P＜0.01;星形胶质细胞,F＝5.000,P＜0.01),黄芩甙浓度越高,则细胞存活率越高.结论构建了一个H2O2氧化损伤星形胶质细胞的模型.在2.5～40μmol/L浓度范围内,黄芩甙对神经元和星形胶质细胞均无毒性作用.但黄芩甙能够拮抗H2O2所致的神经元和星形胶质细胞氧化损伤,而且这种作用呈剂量依赖性.
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聪圣胶囊对小鼠脑缺血损伤后细胞内游离钙含量的影响
目的:研究聪圣胶囊对小鼠脑缺血再灌注后脑组织突触体及拟缺血损伤神经细胞内[Ca2+]i的影响,分析聪圣胶囊抗脑缺血损伤的作用机制.方法:采用Fura-2/AM双波长荧光分光光度法,检测小鼠脑组织突触体和胎鼠神经细胞悬液内[Ca2+]i.结果:聪圣胶囊3g/kg和9g/kg灌胃给药可减轻小鼠脑缺血再灌注后突触体内钙超载程度;聪圣胶囊含药血清可抑制低糖低氧1h及高浓度(200μmol/L)谷氨酸引起的神经细胞内钙的升高.结论:聪圣胶囊可通过减轻脑缺血损伤后钙超载程度来发挥抗脑缺血作用.
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参麦注射液对神经细胞凋亡及胞浆钙变化的影响
目的：研究神经细胞经缺氧/缺糖培养诱导的凋亡发生率、胞内游离钙离子变化及参麦注射液的治疗作用。方法：碘化丙啶染色，流式细胞仪定量分析细胞凋亡百分率；Fluo-3负载，流式细胞仪观察胞内钙平均荧光值变化。结果：缺氧/缺糖培养可诱导神经细胞凋亡和引起细胞内游离钙离子增高，参麦注射液能抑制细胞凋亡、降低细胞内游离钙离子浓度。结论：凋亡是神经细胞死亡方式之一，参麦注射液能抑制缺氧/缺糖诱导的神经细胞凋亡及钙超载，有神经细胞保护作用。
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天然药物对脑缺血损伤级联反应和再灌注的作用
天然药物里对脑缺血损伤具有治疗作用的主要是活血化瘀药.中医对缺血性疾病的治疗理论是气血相关理论、活血化瘀理论,治则是活血生肌、行气通脉、补气活血.西医研究显示脑缺血损伤的级联反应分为4个阶段(1),治疗策略是恢复再灌注和保护脑组织.活血化瘀药在治疗缺血性卒中的临床和基础研究方面取得了可喜的进展,非活血化瘀药也可以作用于脑缺血损伤级联反应的某一阶段,保护缺血缺氧的神经细胞.
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中药对中枢神经细胞基因表达影响的研究进展
随着生命科学的发展,尤其是分子生物学在各学科的渗入,使中医药实验研究深入到分子、基因水平.近年来,国内许多科研单位及学者已着手中药对神经细胞基因表达调控的研究,而且,现代药理研究表明,中药作用原理与其生物活性成分调控基因表达有关[1],本文就中药对中枢神经细胞基因表达的影响进行综述.
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核因子-κB在黄芩甙诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞中的作用
目的研究核因子-κB(NF-κB)在黄芩甙诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞中的作用.方法在无血清条件下,以中药单体黄芩甙作为主要诱导剂,诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经细胞;同时以无血清培养基为对照组.采用免疫荧光细胞化学染色检测神经细胞标记蛋白表达和NF-κB亚基P65核移位情况;蛋白质印迹(Western blot)检测细胞中NF-κB抑制蛋白(IκBα)表达变化;原位末端标记(TUNEL法)染色评价细胞凋亡率.结果黄芩甙诱导后细胞形成较典型的神经细胞形态,同时表达多种神经细胞标记蛋白.对照组无类似情况,但出现P65由胞浆向胞核移位,细胞内IκBα表达水平显著降低,细胞凋亡率为(28.2±6.1)%;黄芩甙诱导后P65信号主要仍在胞浆中表达,细胞内IκBα表达水平降低程度较少,细胞凋亡率[(12.2±2.8)%],也显著低于对照组(P＜0.01).结论黄芩甙可抑制NF-κB的活化,在骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的过程中可能起到一定的作用.
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脑溢安颗粒对脑出血大鼠脑内细胞间粘附分子-1表达和中性白细胞浸润及神经细胞损伤的影响
目的:探讨脑溢安颗粒(简称脑溢安)对脑出血后脑内炎症损伤的影响.方法:采用胶原酶诱导的大鼠脑出血模型,分组处理,并用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫组织化学和组织学方法检测术后不同时间各组出血侧脑内细胞间粘附分子-1(ICAM-1)mRNA表达、脑微血管内皮细胞上ICAM-1蛋白表达、中性白细胞浸润和神经细胞损伤情况.结果:正常组和假手术组大鼠术侧脑内检测到低水平ICAM-1 mRNA表达及少量ICAM-1阳性微血管,未见中性白细胞浸润和受损神经细胞.模型组大鼠出血侧脑内ICAM-1 mRNA表达在术后4h显著升高,24h达到高峰,96h仍保持较高水平,168h恢复正常水平;ICAM-1阳性微血管数在术后4h显著增多,48h达到峰值,持续至168h;中性白细胞浸润和神经细胞损伤在术后4h也明显增多,均于48h达到高峰,之后逐渐下降.脑溢安组大鼠出血侧脑内ICAM-1 mRNA表达水平和ICAM-1阳性微血管数显著降低,中性白细胞浸润,神经细胞损伤明显减轻.结论:脑溢安具有抗脑出血后脑内炎症损伤作用,其作用机制可能与抑制ICAM-1介导的中性白细胞浸润有关.
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补肾益脑胶囊将大鼠骨髓间质干细胞诱导为神经细胞的研究
目的：使用补肾益脑胶囊将大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC)体外诱导为神经细胞。方法：体外扩增培养大鼠股骨骨髓细胞。MSC通过补肾益脑胶囊内药粉溶解液含10%胎牛血清的L-DMEM预诱导24h后，用无血清L-DMEM内加入补肾益脑胶囊内药粉溶解液以正式诱导 MSC 分化成神经细胞。通过倒置显微镜对比观察细胞前后的形态变化；神经细胞特征性结构则以尼氏染色法来观察；以免疫细胞化学鉴定有神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元烯醇化酶(NSE)的表达。结果：通过贴壁法成功将大鼠骨髓间质干细胞分离并在体外大量扩增，补肾益脑胶囊诱导3小时后，MSC形态转变为典型的神经样细胞，尼氏染色法显示诱导后的细胞胞体中有尼氏体，免疫细胞化学染色鉴定显示其NSE、nestin表达皆为阳性，GFAP表达阴性。结论：补肾益脑胶囊诱导下大鼠骨髓间质干细胞可分化为多种形态的神经样细胞。
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D-半乳糖脑老化模型小鼠海马神经细胞凋亡的研究
D-半乳糖脑老化小鼠(D-galactose induced aging of murine brain, DGAM)模型表现有空间学习和记忆功能的障碍, 海马神经细胞神经营养因子表达下降, 细胞退行变等现象[1-3].本研究采用流式细胞技术观察了DGAM海马神经细胞是否有凋亡发生, 以便为进一步阐明脑老化的发生机制提供理论依据.
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内源性神经保护蛋白Iduna在新生大鼠脑组织中的表达及定位
目的 明确内源性神经保护蛋白Iduna在新生大鼠脑组织中的表达水平及定位特点.方法 取SD新生鼠各器官组织和脑分区,用Western blot评价Iduna蛋白表达的组织特异性;制作SD新生鼠脑组织石蜡与冰冻切片,免疫组织化学观察Iduna蛋白的表达及定位特点;免疫荧光三标脑组织冰冻切片确认Iduna在神经元及星形胶质细胞中的定位;培养原代神经元及星形胶质细胞,real-time PCR定量分析Iduna mRNA在细胞中的表达和免疫荧光双染NeuN和GFAP验证Iduna的细胞定位.结果 Iduna在新生鼠脑组织中表达丰富,尤其是海马和皮层区域.Iduna主要定位在大脑海马神经元细胞的胞质内(79.85％),原代神经元中也验证了这一结果(80.6％).Iduna mRNA在神经元中的表达丰度远远高于星形胶质细胞(P ＜0.001).结论 脑组织中Iduna主要分布在海马和皮层区域的神经元胞质中,提示其功能可能与神经元的活动密切相关.
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体外诱导恒河猴骨髓基质细胞分化为神经细胞的分化条件
目的比较血清维甲酸(retinoic acid,RA)、胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)等在不同浓度诱导条件下使恒河猴骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells)诱导分化为神经干细胞(NSCs)及成熟神经细胞的分化条件.方法用Nestin、CD133抗体免疫细胞化学染色,鉴定NSCs;用NSE、β-tublin鉴定神经元;用GFAP鉴定神经胶质细胞,膜片钳检测分化成熟细胞的电生理特性.结果培养第8天多数细胞表现出Nestin及CD133抗原阳性,即为NSCs细胞;诱导后3天即有神经元样细胞出现,此后神经元样细胞逐渐增多,膜片钳检测发现这些细胞具有类似神经细胞的电生理特性.同时,与其他培养条件相比较,低浓度血清(2.5%)+RA+GDNF组诱导分化效能高.结论应用RA+GDNF及配合使用低浓度血清能够高效诱导骨髓源NSCs向成熟神经细胞分化.
